基因表達差異分析方法進展

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1、高等真核生物的基因組一般具有80000～100000個基因，而每一個細胞大約只表達其中的15%［1］?；蛟诓煌毎g及不同生長階段的選擇性表達決定了生命活動的多樣性，如發(fā)育與分化、衰老與死亡、內環(huán)境穩(wěn)定、細胞周期調控等。比較細胞間基因表達的差異為我們揭示生命活動的規(guī)律提供了依據?！　∮捎谡婧思毎鹠RNA3′端一般含有Poly（A）尾，因此現有的方法基本上都是利用共同引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA，以cDNA為對象研究基因表達的差異。1992年Liang等［2］建立了一種差異顯示反轉錄PC

2、R法（differentialdisplayreversetranscriptionPCR，DDRT-PCR），為檢測成批基因表達的差異開辟了新天地。迄今為止已出現了大量應用該技術的研究報道［3，4］。然而，盡管應用DDRT-PCR方法已經取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進之中，但它仍然存在幾個難以解決的問題：(1)重復率低，至少有20%的差異條帶不能被準確重復［5］；(2)假陽性率可以高達90%［6］；(3)獲得的差異表達序列極少包含編碼信息。近年來，針對DDRT-PCR方法的不足，又有幾

3、種新的檢測差異表達基因的方法出現，現僅就這方面的進展做一簡要介紹。　　1.基因表達指紋（geneexpressionfingerprinting，GEF）：GEF技術使用生物素標記的引物Bio-T13合成cDNA第一鏈，用dGTP對其進行末端加尾，再以富含C的引物引發(fā)合成cDNA第二鏈。用限制性內切酶消化雙鏈cDNA，以交聯有抗生物素蛋白的微球捕獲cDNA3′端，以T4DNA連接酶連接同前述內切酶相對應的適配子，并以Bio-T13及適配子中的序列作為新的引物進行特異的PCR擴增，得到大量的特異c

4、DNA片段。適配子末端被32P-dATP標記后，固定于微球上的cDNA片段經過一系列酶切，產生的酶切片段從微球表面釋放出來，其中那些含有標記末端的片段經凝膠電泳后構成mRNA指紋圖譜。通過分析不同細胞間的指紋圖譜就能得到差異表達的序列［7］。GEF技術所需的工作量較DDRT-PCR明顯減少，由于用酶切反應替代了條件不嚴格的PCR反應，其重復性也較好，假陽性率低，并且所獲得的片段中包含有一定的編碼信息。GEF技術最大的缺點在于電泳技術的局限。由于它的指紋圖譜要顯示在同一塊電泳膠上，經過幾輪酶切之后

5、常會得到1000～2000條電泳帶，而現有的PAGE電泳很少能分辨超過400條帶，故只有15%～30%的mRNA能夠被辨認出來，因此得到的只能是高表達基因。如果希望尋找部分新基因，這是一種比較簡單有效的方法；如果希望得到有關某種細胞的基因表達譜，可能比較困難；采用雙向電泳技術可能會有所幫助［8］?！　?．基因表達系統(tǒng)分析（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）：SAGE法的建立基于兩條理論。首先，一段來自某個轉錄子確定位置的核苷酸，其長度只要有9～10個bp，就

6、能夠特異地確認該轉錄子。第二，對短片段標簽的鏈接有利于在同一克隆中對多個標簽測序。SAGE也是用生物素標記的Bio-Oligo(dT)為引物合成雙鏈cDNA，然后以限制酶（錨定酶）進行酶切，捕獲cDNA3′端。在此處產物被分為兩部分，分別與包含有IIS型內切酶（標簽酶）位點的A、B連接子相接。IIS型內切酶的特點是作用位點處于識別位點之外。這樣經過酶切，就有可能得到只有9～10bp的標簽序列。每兩個標簽的鈍端結合后成為PCR的模板，以基于A、B連接子的引物進行PCR反應的結果是得到了大量每條包含

7、兩個不同來源標簽的序列，接下來再用錨定酶酶切、連接，就能將多個不同的標簽鏈接在一起（大約為每條包含數十個不同來源的標簽），克隆至質粒載體中后集中測序［9，10］。SAGE的最終結果是通過計算機統(tǒng)計得到的，根據某個標簽出現頻率的高低來判斷并計算其所屬基因表達的豐度。對于在數據庫中找不到對應序列的標簽，還可以利用13bp的寡核苷酸探針（9bp加上錨定酶識別位點的4bp）對cDNA文庫進行篩選，以尋找新基因。SAGE可以檢測不同細胞間已知基因表達的具體差異，精確到每個細胞中大約有多少拷貝，可以建立較全

8、面的基因表達譜，系統(tǒng)地分析基因表達的差異。它的缺點在于工作量非常大，有大量的測序及計算機分析任務；而且，對于尋找新基因而言，僅用長度為13bp的寡核苷酸探針篩選cDNA文庫是很不嚴格的，根據我們的經驗，往往是假陽性結果居多?！　?.cDNA3′端限制酶切片段顯示（displayof3′endrestrictionfragmentsofcDNAs）:cDNA3′端RFD利用帶有“踵”結構的錨定Oligo(dT)引物合成cDNA第一鏈，以Okayama和Berg的置換法合成cDNA第二鏈，然后將雙鏈