實(shí)驗(yàn)2熒光顯微鏡的使用.ppt

《實(shí)驗(yàn)2熒光顯微鏡的使用.ppt》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、任課教師：細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡的使用實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諢晒怙@微鏡的結(jié)構(gòu)、原理及其使用方法。實(shí)驗(yàn)用品熒光顯微鏡及熒光裝置附件。人口腔上皮細(xì)胞裝片，植物莖部組織裝片。實(shí)驗(yàn)原理熒光顯微鏡是一種較為常用的光學(xué)顯微鏡。它是由光源、濾色鏡系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。其基本原理是利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長的熒光，從而用于對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。透射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈箱透射熒光顯微鏡原理目鏡吸收濾色鏡物鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈透射熒光顯微鏡原理反射熒光顯微鏡原理汞燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡標(biāo)本實(shí)驗(yàn)原理某些物質(zhì)

2、經(jīng)波長較短的光照射后，分子被激活,吸收能量后呈激發(fā)態(tài)。其能量部分轉(zhuǎn)化為熱能或用于光化學(xué)反應(yīng)外，相當(dāng)一部分則以波長較長的光能形式輻射出來，這種波長長于激發(fā)光的可見光稱為熒光。熒光顯微鏡是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。什么是熒光?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。保持固有的熒光特性熒光波長＞激發(fā)波長熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率熒光的性質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：檢出能力高對細(xì)胞的刺激小能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察熒光的有

3、無、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途熒光光源的作用熒光光源不是作為照明的，而是作為熒光色素產(chǎn)生熒光的激發(fā)光。實(shí)驗(yàn)原理熒光有兩種類型，一種是標(biāo)本自身的原有熒光（自發(fā)熒光），另一種是利用熒光色素和細(xì)胞的特定部分反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光（次生熒光）。自發(fā)熒光：在生物的某些組織中，經(jīng)紫外線照射后能直接發(fā)射出熒光的稱為自發(fā)熒光（或直接熒光）。如植物組織中的葉綠素，經(jīng)紫外線照射后，即可發(fā)出紅色熒光。次生熒光：有些生物組織經(jīng)紫外線照射后，并不能發(fā)出熒光，但是當(dāng)它吸收熒光染料后也可以產(chǎn)生熒光，稱為次生熒光（或間接熒光）。如吖啶橙，DAPI均可檢測細(xì)胞內(nèi)的核酸。熒光顯微

4、鏡的基本結(jié)構(gòu)組成一、光源由于標(biāo)本發(fā)出的熒光和激發(fā)光相比，是非常微弱的，因此熒光顯微鏡的光源強(qiáng)度必須很高，所以對于熒光顯微鏡的光源我們通常采用高壓汞燈。汞燈能以最小的表面發(fā)出最大數(shù)量的紫外光和藍(lán)光，且光亮度大，光度穩(wěn)定。它是用石英玻璃制作，中間呈球形，有兩個鎢電極，內(nèi)充一定數(shù)量的汞和少量氬氖混合氣體。一、光源工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時，可達(dá)50～70個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)。超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。

5、因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時盡量減少啟動次數(shù)。燈泡在使用過程中其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min。一、光源超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動幾個部分。在燈室上有調(diào)節(jié)　燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強(qiáng)烈，因此燈泡必須

6、置燈室中方可點(diǎn)燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時造成操作。一、光源濾色鏡按用途或功能，主要分為兩類：1、激發(fā)濾色鏡（exciterfilter）對于光源發(fā)出的混合光，選擇透過能使標(biāo)本產(chǎn)生熒光的特定波長的光，同時阻擋對激發(fā)熒光無關(guān)的光。熒光染料均有一定的吸收光譜（激發(fā)峰值），利用濾色鏡對光線選擇吸收的能力，選用其透射光譜，恰為熒光染料的最大吸收光譜（激發(fā)峰值）的激發(fā)濾色鏡，以便從汞燈發(fā)出的廣譜光波中，選擇透過最宜波段的光線供用。二、濾色鏡系統(tǒng)2、阻擋濾色鏡（barrierfilter）阻擋濾色鏡是用來阻擋掉沒有被標(biāo)本吸收的激發(fā)光和某些波長較短的光線以及沒有被選擇透過的熒光，以防傷害眼睛。阻擋濾色

7、鏡的選用，應(yīng)視熒光染料的熒光光譜而定，要能夠最大限度的透過所需熒光并阻斷短波光以及不需要波長的熒光。二、濾色鏡系統(tǒng)濾鏡一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號特點(diǎn)。如德國產(chǎn)品（Schott）BG12，就是種藍(lán)色玻璃，B是藍(lán)色的第一個字母，G是玻璃的第一個字母；我國產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾鏡名為QB24，Q是青色（藍(lán)色）拼音的第一個字母，B是玻璃拼音的第一個字母。不過有的濾