實(shí)驗(yàn)2熒光顯微鏡的使用.ppt

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1、任課教師：細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡的使用實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諢晒怙@微鏡的結(jié)構(gòu)、原理及其使用方法。實(shí)驗(yàn)用品熒光顯微鏡及熒光裝置附件。人口腔上皮細(xì)胞裝片，植物莖部組織裝片。實(shí)驗(yàn)原理熒光顯微鏡是一種較為常用的光學(xué)顯微鏡。它是由光源、濾色鏡系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。其基本原理是利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，使之產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，從而用于對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀(guān)察檢測(cè)。透射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡暗場(chǎng)聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈箱透射熒光顯微鏡原理目鏡吸收濾色鏡物鏡暗場(chǎng)聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈透射熒光顯微鏡原理反射熒光顯微鏡原理汞燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡標(biāo)本實(shí)驗(yàn)原理某些物質(zhì)

2、經(jīng)波長(zhǎng)較短的光照射后，分子被激活,吸收能量后呈激發(fā)態(tài)。其能量部分轉(zhuǎn)化為熱能或用于光化學(xué)反應(yīng)外，相當(dāng)一部分則以波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光能形式輻射出來(lái)，這種波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的可見(jiàn)光稱(chēng)為熒光。熒光顯微鏡是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀(guān)察標(biāo)本的熒光圖像。什么是熒光?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。保持固有的熒光特性熒光波長(zhǎng)＞激發(fā)波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率熒光的性質(zhì)優(yōu)點(diǎn)：檢出能力高對(duì)細(xì)胞的刺激小能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀(guān)察熒光的有

3、無(wú)、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別發(fā)熒光量的測(cè)定對(duì)物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途熒光光源的作用熒光光源不是作為照明的，而是作為熒光色素產(chǎn)生熒光的激發(fā)光。實(shí)驗(yàn)原理熒光有兩種類(lèi)型，一種是標(biāo)本自身的原有熒光（自發(fā)熒光），另一種是利用熒光色素和細(xì)胞的特定部分反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光（次生熒光）。自發(fā)熒光：在生物的某些組織中，經(jīng)紫外線(xiàn)照射后能直接發(fā)射出熒光的稱(chēng)為自發(fā)熒光（或直接熒光）。如植物組織中的葉綠素，經(jīng)紫外線(xiàn)照射后，即可發(fā)出紅色熒光。次生熒光：有些生物組織經(jīng)紫外線(xiàn)照射后，并不能發(fā)出熒光，但是當(dāng)它吸收熒光染料后也可以產(chǎn)生熒光，稱(chēng)為次生熒光（或間接熒光）。如吖啶橙，DAPI均可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的核酸。熒光顯微

4、鏡的基本結(jié)構(gòu)組成一、光源由于標(biāo)本發(fā)出的熒光和激發(fā)光相比，是非常微弱的，因此熒光顯微鏡的光源強(qiáng)度必須很高，所以對(duì)于熒光顯微鏡的光源我們通常采用高壓汞燈。汞燈能以最小的表面發(fā)出最大數(shù)量的紫外光和藍(lán)光，且光亮度大，光度穩(wěn)定。它是用石英玻璃制作，中間呈球形，有兩個(gè)鎢電極，內(nèi)充一定數(shù)量的汞和少量氬氖混合氣體。一、光源工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過(guò)程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過(guò)程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類(lèi)熒光物質(zhì)。超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。

5、因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開(kāi)動(dòng)一次工作時(shí)間愈短，則壽命愈短，如開(kāi)一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù)。燈泡在使用過(guò)程中其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng)。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min。一、光源超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動(dòng)幾個(gè)部分。在燈室上有調(diào)節(jié)　燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線(xiàn)強(qiáng)烈，因此燈泡必須

6、置燈室中方可點(diǎn)燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時(shí)造成操作。一、光源濾色鏡按用途或功能，主要分為兩類(lèi)：1、激發(fā)濾色鏡（exciterfilter）對(duì)于光源發(fā)出的混合光，選擇透過(guò)能使標(biāo)本產(chǎn)生熒光的特定波長(zhǎng)的光，同時(shí)阻擋對(duì)激發(fā)熒光無(wú)關(guān)的光。熒光染料均有一定的吸收光譜（激發(fā)峰值），利用濾色鏡對(duì)光線(xiàn)選擇吸收的能力，選用其透射光譜，恰為熒光染料的最大吸收光譜（激發(fā)峰值）的激發(fā)濾色鏡，以便從汞燈發(fā)出的廣譜光波中，選擇透過(guò)最宜波段的光線(xiàn)供用。二、濾色鏡系統(tǒng)2、阻擋濾色鏡（barrierfilter）阻擋濾色鏡是用來(lái)阻擋掉沒(méi)有被標(biāo)本吸收的激發(fā)光和某些波長(zhǎng)較短的光線(xiàn)以及沒(méi)有被選擇透過(guò)的熒光，以防傷害眼睛。阻擋濾色

7、鏡的選用，應(yīng)視熒光染料的熒光光譜而定，要能夠最大限度的透過(guò)所需熒光并阻斷短波光以及不需要波長(zhǎng)的熒光。二、濾色鏡系統(tǒng)濾鏡一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號(hào)特點(diǎn)。如德國(guó)產(chǎn)品（Schott）BG12，就是種藍(lán)色玻璃，B是藍(lán)色的第一個(gè)字母，G是玻璃的第一個(gè)字母；我國(guó)產(chǎn)品的名稱(chēng)已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾鏡名為QB24，Q是青色（藍(lán)色）拼音的第一個(gè)字母，B是玻璃拼音的第一個(gè)字母。不過(guò)有的濾