酶動力學方法.docx

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1、酶學性質(zhì)研究1.化合物對酶可逆性抑制測定1.1大體積稀釋法將側(cè)活體系所需濃度的酶與10倍IC50濃度的化合物孵育30Min,以使化合物與酶充分作用。同樣濃度的酶與同樣體積的化合物的溶劑孵育，作為對照；孵育結束后，將上述混合物100倍稀釋至反應溶液（此時，酶濃度至測活濃度，化合物濃度至0.1倍IC50)；加入底物啟動反應，檢測酶促-時間曲線；比較實驗樣品與對照稀釋后的酶促曲線。1.2透析法將酶與高濃度的化合物孵育足夠的時間，以使酶活性被充分抑制。孵育結束后，將上述混合液到大體積反應溶液充分透析，對照樣品以同樣的方法透析；透析完全后，測定蛋白濃度

2、和酶活性；比較實驗樣品以及對照樣品透稀前后的酶比活性；根據(jù)透稀前后的酶比活性的恢復情況，確定抑制劑的可逆性。2.化合物抑制類型研究2.1Km值和kcat測定測定不同底物濃度時，酶促反應的初速度。對測得的反應速度與相應底物濃度進行回歸分析，求得Km值。計算公式為米氏方程（Michaelis-Mentenequation）：n=Vmax*[S]/(Km+[S])（公式1），n代表反應初速度，Vmax代表最大反應速度，[S]代表底物濃度。此運算可同時得到Vmax。根據(jù)公式Vmax＝kcat*[E]（公式2）計算kcat；其中，Vmax為最大反應速度

3、，在計算Km值時求得；[E]為酶濃度3.可逆性抑制劑抑制類型測定3.1競爭型抑制劑通過不同濃度抑制對酶的Km，Vmax變化趨勢的影響，可以初步確定抑制類型。隨抑制劑濃度的增加Km增大，Vmax基本不變。最后，利用雙倒數(shù)作圖確認抑制劑性質(zhì)，即在不同抑制濃度條件下，底物濃度倒數(shù)（1/[S]）對相應反應速度倒數(shù)(1/[V])做圖。不同濃度的抑制劑對應的擬合直線交于Y軸同一點。3.2非競爭型抑制劑通過不同濃度抑制對酶的Km，Vmax變化趨勢的影響，可以初步確定抑制類型。隨抑制劑濃度的增加Km基本不變，Vmax降低。最后，利用雙倒數(shù)作圖確認抑制劑性質(zhì)，

4、即在不同抑制濃度條件下，底物濃度倒數(shù)（1/[S]）對相應反應速度倒數(shù)(1/[V])做圖。不同濃度的抑制劑對應的擬合直線交于X軸同一點3.3反競爭型抑制劑通過不同濃度抑制對酶的Km，Vmax變化趨勢的影響，可以初步確定抑制類型。隨抑制劑濃度的增加Km降低，Vmax降低。最后，利用雙倒數(shù)作圖確認抑制劑性質(zhì)，即在不同抑制濃度條件下，底物濃度倒數(shù)（1/[S]）對相應反應速度倒數(shù)(1/[V])做圖。不同濃度的抑制劑對應的擬合直線平行