酶動(dòng)力學(xué)方法.docx

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1、酶學(xué)性質(zhì)研究1.化合物對(duì)酶可逆性抑制測(cè)定1.1大體積稀釋法將側(cè)活體系所需濃度的酶與10倍IC50濃度的化合物孵育30Min,以使化合物與酶充分作用。同樣濃度的酶與同樣體積的化合物的溶劑孵育，作為對(duì)照；孵育結(jié)束后，將上述混合物100倍稀釋至反應(yīng)溶液（此時(shí)，酶濃度至測(cè)活濃度，化合物濃度至0.1倍IC50)；加入底物啟動(dòng)反應(yīng)，檢測(cè)酶促-時(shí)間曲線；比較實(shí)驗(yàn)樣品與對(duì)照稀釋后的酶促曲線。1.2透析法將酶與高濃度的化合物孵育足夠的時(shí)間，以使酶活性被充分抑制。孵育結(jié)束后，將上述混合液到大體積反應(yīng)溶液充分透析，對(duì)照樣品以同樣的方法透析；透析完全后，測(cè)定蛋白濃度

2、和酶活性；比較實(shí)驗(yàn)樣品以及對(duì)照樣品透稀前后的酶比活性；根據(jù)透稀前后的酶比活性的恢復(fù)情況，確定抑制劑的可逆性。2.化合物抑制類型研究2.1Km值和kcat測(cè)定測(cè)定不同底物濃度時(shí)，酶促反應(yīng)的初速度。對(duì)測(cè)得的反應(yīng)速度與相應(yīng)底物濃度進(jìn)行回歸分析，求得Km值。計(jì)算公式為米氏方程（Michaelis-Mentenequation）：n=Vmax*[S]/(Km+[S])（公式1），n代表反應(yīng)初速度，Vmax代表最大反應(yīng)速度，[S]代表底物濃度。此運(yùn)算可同時(shí)得到Vmax。根據(jù)公式Vmax＝kcat*[E]（公式2）計(jì)算kcat；其中，Vmax為最大反應(yīng)速度

3、，在計(jì)算Km值時(shí)求得；[E]為酶濃度3.可逆性抑制劑抑制類型測(cè)定3.1競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑通過(guò)不同濃度抑制對(duì)酶的Km，Vmax變化趨勢(shì)的影響，可以初步確定抑制類型。隨抑制劑濃度的增加Km增大，Vmax基本不變。最后，利用雙倒數(shù)作圖確認(rèn)抑制劑性質(zhì)，即在不同抑制濃度條件下，底物濃度倒數(shù)（1/[S]）對(duì)相應(yīng)反應(yīng)速度倒數(shù)(1/[V])做圖。不同濃度的抑制劑對(duì)應(yīng)的擬合直線交于Y軸同一點(diǎn)。3.2非競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑通過(guò)不同濃度抑制對(duì)酶的Km，Vmax變化趨勢(shì)的影響，可以初步確定抑制類型。隨抑制劑濃度的增加Km基本不變，Vmax降低。最后，利用雙倒數(shù)作圖確認(rèn)抑制劑性質(zhì)，

4、即在不同抑制濃度條件下，底物濃度倒數(shù)（1/[S]）對(duì)相應(yīng)反應(yīng)速度倒數(shù)(1/[V])做圖。不同濃度的抑制劑對(duì)應(yīng)的擬合直線交于X軸同一點(diǎn)3.3反競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑通過(guò)不同濃度抑制對(duì)酶的Km，Vmax變化趨勢(shì)的影響，可以初步確定抑制類型。隨抑制劑濃度的增加Km降低，Vmax降低。最后，利用雙倒數(shù)作圖確認(rèn)抑制劑性質(zhì)，即在不同抑制濃度條件下，底物濃度倒數(shù)（1/[S]）對(duì)相應(yīng)反應(yīng)速度倒數(shù)(1/[V])做圖。不同濃度的抑制劑對(duì)應(yīng)的擬合直線平行