果膠酶產(chǎn)生菌的篩選及其條件優(yōu)化2.doc

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1、實(shí)驗(yàn)序號(hào)實(shí)驗(yàn)7實(shí)驗(yàn)名稱特定產(chǎn)物工業(yè)生產(chǎn)菌種發(fā)酵及應(yīng)用性質(zhì)研究（一）實(shí)驗(yàn)時(shí)間2011.11.15--12.15實(shí)驗(yàn)室118一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握菌種選育、菌種發(fā)酵條件的優(yōu)化和微生物酶制劑酶活測(cè)定的基本方法；2、掌握從土壤中分離酶產(chǎn)生菌的方法，學(xué)會(huì)運(yùn)用微生物生態(tài)知識(shí)分離產(chǎn)酶微生物；3、掌握果膠酶活性測(cè)定的原理，學(xué)會(huì)果膠酶活性的測(cè)定方法；4、了解酶學(xué)性質(zhì)的研究。二、實(shí)驗(yàn)原理1、果膠質(zhì)：果膠是植物中的一種酸性多糖物質(zhì)，它通常為白色至淡黃色粉末，稍帶酸味，具有水溶性，工業(yè)上即可分離，其分子量約5萬——30萬，主要存在于植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)層，為內(nèi)部細(xì)胞的支撐物質(zhì)。果膠質(zhì)是一類高分子碳水化合物，普

2、遍存在與高等植物的細(xì)胞壁及細(xì)胞壁間作為結(jié)構(gòu)物質(zhì)。2、果膠酶：分解果膠的一個(gè)多酶復(fù)合物，通常包括原果膠酶、果膠甲酯水解酶、果膠酸酶。通過它們的聯(lián)合作用使果膠質(zhì)得以完全分解。天然的果膠質(zhì)在原果膠酶作用下，轉(zhuǎn)化成水可溶性的果膠；果膠被果膠甲酯水解酶催化去掉甲酯基團(tuán)，生成果膠酸；果膠酸經(jīng)果膠酸水解酶類和果膠酸裂合酶類降解生成半乳糖醛酸。細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌都可以發(fā)酵產(chǎn)生果膠酶，但是目前商品果膠酶主要來自于霉菌。果膠酶主要用于果膠的分解，在水果的加工、葡萄酒的生產(chǎn)、麻類脫膠和飼料方面。3、果膠酶的酶活測(cè)定方法：①、粘度降低法：利用粘度計(jì)測(cè)量一定溫度、酶濃度和一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)果膠溶液的粘

3、度降低值。②、脫膠作用時(shí)間法：以脫膠作用的時(shí)間來測(cè)定果膠酶的酶活力。③、次亞碘酸法：用滴定法定量測(cè)定半乳糖醛酸的生成量，以表示果膠酶的活力。④、還原糖法（DNS法）：測(cè)定在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，水解果膠產(chǎn)生的還原糖的量。根據(jù)果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸是一種還原糖，與3，5-二硝基水楊酸共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定的范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈比例關(guān)系，可利用比色法在540nm進(jìn)行測(cè)定。4、影響微生物發(fā)酵的因素有很多；①、培養(yǎng)基的成分（營養(yǎng)物質(zhì)及其濃度）例如：碳源的種類、氮源的種類、碳源的濃度、氮源的濃度、無機(jī)鹽、水含量等；②、菌種接種的量；③、發(fā)酵條件：溫度、

4、PH、溶解氧等；④、附加條件：誘導(dǎo)物、表面活性劑等（5）、酶催化反應(yīng)的進(jìn)行也受到多方面因素的影響：底物濃度、酶濃度、溫度、PH、激活劑、抑制劑。（6）、果膠酶的最適催化PH為酸性，在3.5左右，而DNS的顯色PH為堿性。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料：1、實(shí)驗(yàn)設(shè)備：天平、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、電磁爐、恒溫水浴鍋、計(jì)時(shí)器（精確到秒）、分光光度計(jì)、離心機(jī)、烘箱、PH計(jì)數(shù)器。2、實(shí)驗(yàn)用具：燒杯、三角瓶、試管、移液槍（槍頭）、量筒、容量瓶、試劑瓶、研缽、試管架、玻璃棒、紗布、繩子、離心管、比色皿、培養(yǎng)皿。3、實(shí)驗(yàn)試劑：①、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液：稱取檸檬酸15.652克，檸檬酸鈉7.5克，溶解定

5、容至1000ml，用0.1MNaOH或0.1MHCl調(diào)節(jié)PH至3.0。②、底物——0.25%果膠溶液：稱取0.25g果膠，用PH=3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，在電磁爐上加熱至完全溶解，用緩沖液定容至100mL，儲(chǔ)存于4℃，7天內(nèi)有效。③、DNS試劑：稱取酒石酸鉀鈉182.0g，溶解于500mL水中，加熱（不超過50℃），于熱溶液中依次加入2，5-二硝基水楊酸6.3g，氫氧化鈉21.0g，苯酚5.0g，攪拌均勻至溶解，冷卻后定容1000mL，儲(chǔ)存于棕色瓶中，室溫保存，7-10天后過濾使用。4、實(shí)驗(yàn)材料：從周圍環(huán)境采集的土樣或腐爛的水果上的霉菌。5、培養(yǎng)基：①、基本培養(yǎng)基；成分及條

6、件果膠磷酸二氫鈉蛋白胨瓊脂pH含量及水平1%0.5%1%2.0%4.5②、分離培養(yǎng)基；成分及條件果膠磷酸二氫鈉瓊脂pH含量及水平0.5%0.5%2.0%4.5③、發(fā)酵培養(yǎng)基；成分及條件果膠磷酸二氫鈉蛋白胨pH含量及水平1%0.5%1%4.5④、種子培養(yǎng)基；成分及條件麩皮橘子粉硫酸銨葡萄糖磷酸二氫鉀pH含量及水平3.0%2.0%0.5%1%0.1%4.5⑤、固體發(fā)酵培養(yǎng)基；成分及條件麩皮橘子粉硫酸銨葡萄糖水含量及水平10g2.5g0.1g0.125g15mL四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制；1、先配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，用選定的顯色劑進(jìn)行顯色。（1）、精確稱取0.1

7、00g半乳糖醛酸，用緩沖液定容至100mL，制得濃度為1mg/mL的半乳糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）、如下表配制溶液；半乳糖醛酸溶液體積0.00.20.40.60.81.01.2半乳糖醛酸0.00.20.40.60.81.01.2緩沖液(ml)2.01.81.61.41.21.00.8DNS(ml)3333333定容總體積(ml)20202020202020OD(540nm)0.0000.0850.2410.4050.5500.7030.850（3