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1、四、人源性單克隆抗體 和基因工程抗體11.EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)：利用類(lèi)似于皰疹病毒的EB病毒在體外直接感染人外周血淋巴細(xì)胞（來(lái)源于淋巴結(jié)、扁桃體、臍帶血、外周血等），使之轉(zhuǎn)化獲得永生能力得到人B淋巴細(xì)胞系，這些細(xì)胞可在體外分泌人抗體。(一)、人源性單克隆抗體2技術(shù)同鼠－鼠雜交瘤，親本骨髓瘤細(xì)胞主要有來(lái)自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、NS-1，來(lái)自大鼠的骨髓瘤Y3Ag1.2.3等；親本B細(xì)胞來(lái)源于人外周血淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、脾細(xì)胞。但人－鼠雜交瘤的單克隆抗體分泌性能不穩(wěn)定，多數(shù)情況下由于人染色體的丟失導(dǎo)致雜交瘤細(xì)胞失去
2、分泌抗體的能力。2.人－鼠雜交瘤單克隆抗體：33.人－人雜交瘤單克隆抗體：人－人雜交瘤操作步驟基本上與小鼠－小鼠雜交瘤技術(shù)相同，使用人的骨髓瘤細(xì)胞與人的B淋巴細(xì)胞融合；但可供利用的人骨髓瘤細(xì)胞種類(lèi)非常有限，人的骨髓瘤細(xì)胞在融合率、非分泌型方面仍不及小鼠骨髓瘤細(xì)胞，而且人不能像小鼠那樣進(jìn)行高度免疫，B淋巴細(xì)胞常限于取自外周血(小鼠取自動(dòng)物脾臟)，激活狀態(tài)不適合做融合；故人－人雜交瘤細(xì)胞在融合、融合后的篩選以及融合細(xì)胞分泌抗體方面仍不理想。44.構(gòu)建轉(zhuǎn)人Ig基因組小鼠?將改造過(guò)的人的抗體基因組導(dǎo)入小鼠胚胎，得到在免疫后能
3、產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。改造過(guò)的抗體除了構(gòu)成抗原識(shí)別與抗原結(jié)合部位的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是鼠源的以外，其余部分均是人源的。?用人Ig基因組取代小鼠Ig基因組獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，以后僅需免疫小鼠制作單克隆抗體，但獲得的是人抗體而非小鼠抗體。該技術(shù)難度較大，但已有成功的報(bào)道。55.嚴(yán)重免疫缺陷小鼠制備人單克隆抗體：SCID小鼠具有嚴(yán)重免疫缺陷，對(duì)外源組織無(wú)免疫排斥反應(yīng)，故這種小鼠可接受人體組織或器官移植，形成人－鼠嵌合體小鼠。將人免疫干細(xì)胞移植到SCID小鼠體內(nèi)，SCID小鼠獲得了人的免疫系統(tǒng)。這種小鼠可用任何抗原免疫，
4、從激活的淋巴細(xì)胞中富集抗原特異性人源性B淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞融合或制備抗體庫(kù)。6(二)、基因工程抗體基因工程抗體是利用基因工程的手段獲得人源性抗體，主要包括以下幾個(gè)方面：人－鼠嵌合抗體、改型抗體、抗體片段、噬菌體抗體文庫(kù)技術(shù)、表位印跡選擇技術(shù)等。7抗體的重輕鏈構(gòu)成的可變區(qū)(V區(qū))與識(shí)別抗原有關(guān)，具有特異性；而恒定區(qū)(C區(qū))與效應(yīng)功能有關(guān)。人－鼠嵌合抗體就是通過(guò)人工改造使抗體的V區(qū)是鼠源的，而C區(qū)是人源的。如此改造的嵌合抗體保留了原來(lái)鼠源單克隆抗體的特異性和親和力，人抗小鼠抗體反應(yīng)(HAMA)也明顯減弱。1.人－鼠
5、嵌合抗體：8人－鼠嵌合抗體的制備92.改型抗體：也稱(chēng)CDR移植。用鼠源的CDR(可變區(qū)中和抗原互補(bǔ)結(jié)合構(gòu)成抗原結(jié)合部位的部分）取代人抗體中相應(yīng)的CDR部位，使得抗體中除構(gòu)成抗原結(jié)合部位的3個(gè)CDR是鼠源以外，其余均為人源。這種抗體在人體內(nèi)免疫性大大降低。10改型抗體（CDR移植）11Fab抗體：抗體Y形的兩個(gè)臂稱(chēng)為Fab，它由可變區(qū)和小部分的恒定區(qū)組成，利用基因工程的方法構(gòu)建具有可變區(qū)和小部分恒定區(qū)的Fab抗體，這樣的抗體仍具有特異結(jié)合抗原的特性。單鏈抗體(ScFv)：用短肽接頭[常用(Gly4Ser)3]將重鏈可變
6、區(qū)和輕鏈可變區(qū)相連，使其分子變小，更有利于穿透組織和清除，而且易構(gòu)建表達(dá)；但親和力會(huì)出現(xiàn)一定的下降。3.抗體片段：124.噬菌體抗體文庫(kù)技術(shù)體外建立一個(gè)相應(yīng)于體內(nèi)B細(xì)胞庫(kù)的抗體庫(kù)，從中篩選所需要的抗體。利用PCR擴(kuò)增重鏈和輕鏈的cDNA，并插入到噬菌體外殼蛋白的編碼基因中，然后感染E.coli，使抗體基因的表達(dá)產(chǎn)物和外殼蛋白一起融合展示在噬菌體表面，成為噬菌體抗體。通過(guò)固相化的抗原進(jìn)行篩選，不能結(jié)合抗原的噬菌體被洗去，結(jié)合的噬菌體被洗脫下來(lái)再次感染細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，多次吸附－洗脫－擴(kuò)增后可獲得所要的抗原特異性的噬菌體抗體
7、。這些抗體可以做到全部為人源的。13145.表位印模選擇技術(shù)：用特定的已知抗原從抗體組合文庫(kù)中或噬菌體抗體文庫(kù)中篩選所需抗體，通過(guò)抗體可變區(qū)與抗原結(jié)合及編碼輕、重鏈可變區(qū)鼠源性與人源性基因置換、匹配，從而獲得能與抗原特異性反應(yīng)的人源性抗體，將篩選到的含人輕、重鏈基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到骨髓瘤SP2/0細(xì)胞中，該細(xì)胞即可產(chǎn)生人單克隆抗體。15單克隆化有限稀釋擴(kuò)大培養(yǎng)單克隆化由單一細(xì)胞長(zhǎng)成16Fab抗體分子的制備17利用基因工程制備單鏈抗體(ScFv)18
