單克隆抗體與基因工程抗體制備.ppt

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1、單克隆抗體與基因工程抗體制備多克隆抗體(Polyclonalantibody)概念給動(dòng)物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清，是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的，稱為多克隆抗體。存在的問題為不均一物質(zhì)特異性和親和力差,批間重復(fù)性差，用于免疫學(xué)檢測(cè)容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)單克隆抗體(Monoclonalantibody,McAb)概念:通過B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.特點(diǎn):針對(duì)單一表位結(jié)構(gòu)相同功能均一雜交瘤技術(shù)的理論基礎(chǔ)

2、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說，即一種克隆只產(chǎn)生一種抗體細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方親代細(xì)胞的特性利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤技術(shù)流程兩種親本細(xì)胞的選擇與制備細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆化兩種親本細(xì)胞的選擇與制備小鼠骨髓瘤細(xì)胞免疫脾細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞系選擇要點(diǎn)：穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP2／0、X63等。保存：防止突變、定期篩選（8-氮鳥嘌呤）防止支原體污染（胎牛血清）融合時(shí)保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，良好的形

3、態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95％一般要求：與骨髓瘤細(xì)胞同源的小鼠（Balb/c小鼠）8～12周齡20g～25g體重用高純度高活性抗原刺激免疫小鼠免疫成功的標(biāo)志是在融合時(shí)脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特異性B細(xì)胞，此時(shí)血清中抗體效價(jià)不一定最高?？扇苄钥乖庖咴匀酰话阋幼魟?，10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔2-4周后加強(qiáng)免疫（量減半，改用不完全佐劑，可反復(fù)多次）。沖擊免疫（融合前3天進(jìn)行）顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果細(xì)胞融合當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞緊密接觸時(shí)，細(xì)胞膜可能融

4、合在一起。融合細(xì)胞含有兩個(gè)不同的細(xì)胞核，稱為異核體，產(chǎn)生具有原來兩個(gè)細(xì)胞基因信息的單個(gè)核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞（hybridcell）。骨髓瘤細(xì)胞PEG雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞細(xì)胞融合劑：PEG作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同免疫脾細(xì)胞：處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞-漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天后的脾臟。融合比例：骨髓瘤細(xì)胞：脾細(xì)胞=1：5或1：10融合劑：40%PEG（分子量1000-2000）融

5、合24小時(shí)后加HAT培養(yǎng)液2周后改用HT培養(yǎng)液2周后改用一般培養(yǎng)液融合后細(xì)胞的類型:未融合的脾細(xì)胞（壽命短，5-7天死亡）雜交瘤細(xì)胞（分泌抗體和永生性）未融合的瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆化細(xì)胞DNA合成途經(jīng)1.替代途徑：次黃嘌呤（H）HGPRT2.主要途徑：氨基酸鳥嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷單磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途徑：胸腺嘧啶核苷（T）HAT選擇培養(yǎng)基的原理HAT選擇培養(yǎng)基組分次黃嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):葉酸拮抗劑胸腺嘧啶核苷

6、（thymidine,T)抗原免疫的脾細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞（B細(xì)胞）（B細(xì)胞惡性腫瘤）1.抗體分泌（Ig+)具永生性2.HGPRT+在HAT生長(zhǎng)PEG融合HAT篩選脾-骨髓瘤細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞）（HGPRT+、Ig+）融合后不同細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基的結(jié)果及命運(yùn)雜交瘤細(xì)胞未融合的脾細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞脾-脾雜交細(xì)胞骨髓瘤-骨髓瘤雜交細(xì)胞陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞在HAT中生長(zhǎng)，其中僅少數(shù)是分泌特異性McAb的細(xì)胞，而且有的培養(yǎng)孔生長(zhǎng)多個(gè)細(xì)胞群落，必須篩選。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10時(shí)，

7、開始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需雜交瘤細(xì)胞系?？煽康暮Y選方法須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤篩選時(shí)機(jī)。克隆化：指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開?？寺』脑瓌t：盡早進(jìn)行，反復(fù)4-5次克隆化方法：有限稀釋法、軟瓊脂平板法、顯微克隆法有限稀釋法特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞陽性雜交瘤細(xì)胞的凍存陽性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時(shí)凍存，防染色體丟失、變異及污染配制方案：雜交

8、瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇單克隆抗體的制備經(jīng)過反復(fù)克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。單抗生產(chǎn)的方法：動(dòng)物體內(nèi)誘生法：小鼠腹腔注射降植丸或液