單克隆抗體與基因工程抗體制備技術(shù)

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1、第四章　單克隆抗體與基因工程抗體制備技術(shù)本章考點(diǎn)　　1.概念　　2.雜交瘤技術(shù)基本原理　　3.雜交瘤抗體的制備技術(shù)　　4.基因工程抗體　　　　由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的針對抗原分子上某一單個(gè)抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。其理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)、且來源容易?！　鹘y(tǒng)的方法是將抗原注入動(dòng)物，由動(dòng)物體內(nèi)B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。由于多數(shù)天然的抗原分子具有多種抗原決定簇，每一種決定簇可激活具有相應(yīng)抗原受體的B細(xì)胞產(chǎn)生針對某一抗原決定簇的抗體。因此，將抗原注入機(jī)體后，刺激多個(gè)B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體是針對多種抗原決定簇的混合抗體，故稱為多克隆抗體（PoAb）。　　第一節(jié)　雜交瘤

2、技術(shù)基本原理　　　　單克隆是指利用在細(xì)胞融合基礎(chǔ)上的B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)?！　‰s交瘤技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細(xì)胞而同時(shí)保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）的主要特征是它的抗體分泌功能，但不能在體外連續(xù)培養(yǎng)，小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即具有所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交細(xì)胞才能具有持續(xù)培養(yǎng)的能力，形成同時(shí)具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞克隆。　　一、B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)　　1.細(xì)胞的選擇和融合：雜交瘤技術(shù)的目的是制備對抗原特異性的單克隆抗體，

3、所以融合一方必須是經(jīng)過抗原免疫的B細(xì)胞，通常選用被免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞，脾淋巴細(xì)胞的主要特征是抗體分泌功能。融合細(xì)胞另一方則要求在培養(yǎng)條件下的永生性，只有腫瘤細(xì)胞才是具備這一條件，所以選擇同一體系的骨髓瘤細(xì)胞，因多發(fā)性骨髓瘤是B細(xì)胞系惡性腫瘤，其特點(diǎn)是穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌免疫球蛋白及細(xì)胞因子、融合率高、是次黃嘌呤磷酸核酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾細(xì)胞融合對象?！　?.選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用：細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷是細(xì)胞DNA合成的途徑；氨甲蝶呤（A）是葉

4、酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，而融合作用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選取出的缺乏HGPRT細(xì)胞株，不能在該培養(yǎng)基上生長，只有融合細(xì)胞具有親代雙方遺傳性能，才能在HAT培養(yǎng)基上長期存活與繁殖?！　?.有限稀釋與抗原特異性的選擇：細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的過程，需在融合細(xì)胞抗體篩選的基礎(chǔ)上進(jìn)行特異性篩選。將融合細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，進(jìn)行克隆化處理，再將陽性細(xì)胞進(jìn)行再次克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株進(jìn)行增殖，再進(jìn)行冰凍，體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種。　　　　　　圖13雜交瘤技術(shù)操作主要流程示意圖　　二、T細(xì)胞雜交瘤　　T細(xì)胞雜交瘤可分為小鼠細(xì)胞雜交瘤和人T

5、細(xì)胞雜交瘤。　　其基本過程是將激活的細(xì)胞與酶缺陷型淋巴瘤細(xì)胞融合，通過有限克隆稀釋，獲得特異性表達(dá)細(xì)胞受體（TCR）或其他功能的雜交瘤細(xì)胞。其主要步驟為：　　1.淋巴瘤細(xì)胞系的選擇　要求有以下特征：　?。?）體外能無限、快速生長?！　。?）融合率高?！　。?）不分泌淋巴因子和殺傷功能?！　。?）缺乏某一特異性的細(xì)胞表面抗原或受體?！　。?）HGPRT酶缺陷型?！　?.特異性細(xì)胞的制備與活化：主要有可溶性抗原誘導(dǎo)激活的細(xì)胞、同種反應(yīng)性細(xì)胞、人的特異性細(xì)胞等?！　?.T細(xì)胞雜交瘤的篩選?！　∪㈥栃噪s交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)　　雜交瘤細(xì)胞形成后的初期很不穩(wěn)定，為確保單克隆抗體的專一性及避免其他

6、陰性細(xì)胞對其生長影響，必須將陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離培養(yǎng)，產(chǎn)生單克隆雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)2～3次檢測均為陽性的雜交瘤單個(gè)細(xì)胞，才能進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。　　克隆化培養(yǎng)后的陽性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時(shí)凍存，最好保存在-196℃液氮中?！　〉诙?jié)　單克隆抗體的制備技術(shù)　　　　利用雜交瘤技術(shù)制備McAb基本原理是根據(jù)三個(gè)原則：（1）淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說；（2）雜交瘤細(xì)胞保持雙方親代細(xì)胞特性化；（3）然后大量培養(yǎng)增殖，制備所需的McAb?！　∫?、單克隆抗體的產(chǎn)生　　1.動(dòng)物體內(nèi)誘生方法：目前McAb治療用或體外診斷用的多數(shù)尚采用這一方法制備。先在小鼠腹腔注射液體石蠟或福氏不完全佐劑，一周后將雜交瘤細(xì)

7、胞懸液注射腹腔，l～2周后，無菌抽取腹水，離心取上清液即可。　　2.體外培養(yǎng)法：這是實(shí)驗(yàn)室制備的方法。將雜交瘤細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待培養(yǎng)液顏色改變或細(xì)胞過多開始死亡時(shí)，收集上清液，離心去掉碎片及細(xì)胞即可。另一種是雜交瘤細(xì)胞高密度培養(yǎng)法。　　二、單克隆抗體的純化及鑒定　　目前常用的純化方法有鹽析、凝膠過濾、離子交換層析和辛酸提取等方法。　　單克隆抗體性質(zhì)鑒定方法如放免測定、補(bǔ)體介導(dǎo)溶血試驗(yàn)、ELISA、免疫酶、玫瑰花結(jié)形成試驗(yàn)等，最常用的為ELI