單克隆抗體與基因工程抗體制備

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1、單克隆抗體與基因工程抗體制備多克隆抗體(Polyclonalantibody)概念給動物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清，是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細胞增殖分化所產(chǎn)生的，稱為多克隆抗體。存在的問題為不均一物質(zhì)特異性和親和力差,批間重復性差，用于免疫學檢測容易出現(xiàn)交叉反應單克隆抗體(Monoclonalantibody,McAb)概念:通過B細胞雜交瘤技術,獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.特點:針對單一表位結(jié)構(gòu)相同功能均一雜交瘤技術的理論基礎淋巴細胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學說，即一種克隆只產(chǎn)生一種抗體細胞融合技術產(chǎn)生的雜交瘤細胞可以保持雙

2、方親代細胞的特性利用代謝缺陷補救機理篩選雜交瘤細胞，雜交瘤技術流程兩種親本細胞的選擇與制備細胞融合雜交瘤細胞的篩選與克隆化兩種親本細胞的選擇與制備小鼠骨髓瘤細胞免疫脾細胞骨髓瘤細胞系選擇要點：穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤細胞系有：NS1、SP2／0、X63等。保存：防止突變、定期篩選（8-氮鳥嘌呤）防止支原體污染（胎牛血清）融合時保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細胞計數(shù)高于95％一般要求：與骨髓瘤細胞同源的小鼠（Balb/c小鼠）8～12周齡20g～25g體重用高純度高活性抗原刺激免疫小鼠免疫成功的標志是在融合時脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特

3、異性B細胞，此時血清中抗體效價不一定最高?？扇苄钥乖庖咴匀?，一般要加佐劑，10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔2-4周后加強免疫（量減半，改用不完全佐劑，可反復多次）。沖擊免疫（融合前3天進行）顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果細胞融合當兩個細胞緊密接觸時，細胞膜可能融合在一起。融合細胞含有兩個不同的細胞核，稱為異核體，產(chǎn)生具有原來兩個細胞基因信息的單個核細胞，稱為雜交細胞（hybridcell）。骨髓瘤細胞PEG雜交瘤細胞脾細胞細胞融合劑：PEG作用機理：誘導細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合作用特點：不同廠商、批號、分子

4、量的PEG，其純度與毒性有所不同免疫脾細胞：處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細胞-漿母細胞。一般取最后一次加強免疫3天后的脾臟。融合比例：骨髓瘤細胞：脾細胞=1：5或1：10融合劑：40%PEG（分子量1000-2000）融合24小時后加HAT培養(yǎng)液2周后改用HT培養(yǎng)液2周后改用一般培養(yǎng)液融合后細胞的類型:未融合的脾細胞（壽命短，5-7天死亡）雜交瘤細胞（分泌抗體和永生性）未融合的瘤細胞雜交瘤細胞的篩選與克隆化細胞DNA合成途經(jīng)1.替代途徑：次黃嘌呤（H）HGPRT2.主要途徑：氨基酸鳥嘌呤核苷酸谷氨酰胺（A-）尿核苷單磷酸胸腺嘧啶核苷酸TK3.次要途徑：胸腺嘧啶核苷（T）HAT選擇培養(yǎng)基的原

5、理HAT選擇培養(yǎng)基組分次黃嘌呤（hypoxanthine,H)氨甲喋呤（aminopterin,A):葉酸拮抗劑胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)抗原免疫的脾細胞小鼠骨髓瘤細胞（B細胞）（B細胞惡性腫瘤）1.抗體分泌（Ig+)具永生性2.HGPRT+在HAT生長PEG融合HAT篩選脾-骨髓瘤細胞（雜交瘤細胞）（HGPRT+、Ig+）融合后不同細胞在HAT培養(yǎng)基的結(jié)果及命運雜交瘤細胞未融合的脾細胞未融合的骨髓瘤細胞脾-脾雜交細胞骨髓瘤-骨髓瘤雜交細胞陽性雜交瘤細胞的篩選雜交瘤細胞在HAT中生長，其中僅少數(shù)是分泌特異性McAb的細胞，而且有的培養(yǎng)孔生長多個細胞群落，必須篩選。一般在

6、雜交瘤細胞布滿孔底1/10時，開始檢測特異性抗體，篩選出所需雜交瘤細胞系。可靠的篩選方法須在融合前建立，避免由于方法不當貽誤篩選時機?？寺』褐笇⒖贵w陽性孔進行克隆化。目的是將抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、特異性抗體分泌細胞和無關抗體分泌細胞分開?？寺』脑瓌t：盡早進行，反復4-5次克隆化方法：有限稀釋法、軟瓊脂平板法、顯微克隆法有限稀釋法特點：不需任何特殊設備克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法方法：細胞懸液通過系列稀釋每個培養(yǎng)孔含0.5～1個細胞陽性雜交瘤細胞的凍存陽性雜交瘤細胞應及時凍存，防染色體丟失、變異及污染配制方案：雜交瘤細胞（（1～5）x106/ml)+細胞凍存液(30%～40%牛

7、血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復蘇單克隆抗體的制備經(jīng)過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株應立即擴大培養(yǎng)（除及時凍存的細胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。單抗生產(chǎn)的方法：動物體內(nèi)誘生法：小鼠腹腔注射降植丸或液