最新酶學-04酶分子的化學修飾教學講義PPT.ppt

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1、酶學-04酶分子的化學修飾酶化學修飾的應用領域在基礎酶學研究上探測酶活性必需氨基酸的性質和數(shù)目酶蛋白一級結構的測定酶蛋白的結構變化與運動酶蛋白部分區(qū)域的構象狀態(tài)酶的作用機理與催化反應歷程酶分子的拓撲學以及寡聚酶的亞基結合狀態(tài)酶的固定化技術酶純度的分析與檢測在疾病治療上克服酶在體內的不穩(wěn)定性消除或降低酶的抗原性有助于酶分子到達并集中于病灶細胞在工業(yè)上的應用酶穩(wěn)定性提高，使生產(chǎn)成本降低反應條件的改善和酶壽命的延長導致生產(chǎn)工藝的技術革新和改進。2、大分子共價修飾：利用一些可溶性大分子，通過共價鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許多有用的性質。例如用聚乙二醇共價修飾超氧

2、化物歧化酶（SOD），不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了半衰期，從而提高了藥效。（四）分子內交聯(lián)：增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基經(jīng)過羰二亞胺活化后，可以與一系列二胺發(fā)生作用，使酶的穩(wěn)定性得到改善。（五）分子間交聯(lián)：利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶交聯(lián)在一起形成雜化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交聯(lián)在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；將胰蛋白酶與堿性磷酸脂酶交聯(lián)形成的雜化酶可作為部分代謝途徑的模型。（六）脂質體包埋：一些醫(yī)藥用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量較大，不易進入人體細胞內，而且在體

3、內半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應；用脂質體包埋法紀可解決這些問題。制止提是天然脂類或類固醇組成的微球體，酶分子包埋在其內部，可以通過與細胞的膜融合或內吞作用而進入細胞內。（七）反相膠團微囊化：這是近年來發(fā)展起來的酶在有劑相中進行催化的技術，反相膠團中酶的穩(wěn)定性大大提高；一些表面活性劑溶解在非極性有機溶劑中時可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團，反相膠團是表面活性劑的疏水尾部朝外而極性頭部朝內的微膠團，其內部可容納一定量的水，酶溶解在其中避免變性（見圖）。加H2O疏水尾部親水頭部加酶液SPEEE圖：反相膠團的結構和酶的分布二、酶分子的內部修飾（一）非催化活性基團的修飾：通過對非催化殘基的修飾可以

4、改變酶的動力學性質，改變酶對特殊底物的親和力；通常可被修飾的氨基酸殘基既可以是親核的，也可以是親電子的，還可以是是可氧化殘基。（二）酶蛋白主鏈的修飾：主要是靠酶法進行修飾，用蛋白酶對主聯(lián)進行部分水解，可以改變酶的催化特性。（三）催化活性基團的修飾：通過選擇性修飾催化活性氨基酸的側鏈來實現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基酸側鏈轉化為另一種氨基酸側鏈，這種方法又稱為化學突變法。（四）肽鏈伸展后的修飾：酶蛋白經(jīng)過脲、鹽酸胍處理，使肽鏈充分伸展，對酶分子內部的疏水基團進行修飾，然后在適當條件下，重新進行折疊。三、與輔因子相關的修飾（一）對依賴輔因子的酶可用兩種方法進行修飾：如果輔因子與酶是非共價

5、結合的,可以將輔因子共價結合于酶分子上；引入新的具有更強反應的輔因子。四、金屬酶的金屬取代：酶分子中的金屬離子可以被其他金屬離子取代，可以改變酶的專一性、穩(wěn)定性等。第二節(jié)酶化學修飾的基本要求一、被修飾酶的性質（一）酶的穩(wěn)定性：包括熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，作用溫度以及pH，酶蛋白解離時的電化學性質，抑制劑的性質等。（二）酶活性中心的狀況：包括酶分子活性中心的組成，如參與活性中心的氨基酸殘基、輔因子等。酶分子的形狀、大小以及寡聚酶的亞基組成。（三）酶側鏈基團的性質與反應性1、對巰基的化學修飾：常用的修飾試劑有烷化劑、汞試劑和Ellman試劑等。2、氨基的化學修飾：常用的修飾試劑友乙酸酐、2

6、，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、烷基化時劑、丹磺酰氯(DNS)和苯異硫氰酸酯（PITC)等。3、羧基的化學修飾：水溶性羰二亞胺或氨化反應、硼氟化三甲鋅鹽反應、甲醇-鹽酸酯化反應等。4、咪唑基的修飾反應：焦碳酸二乙酯反應、碘代反應、碘化反應等。5、吲哚基的化學修飾：2-羥基-5-硝基芐溴、光敏試劑、4-硝基苯硫氯等。6、甲硫氨酸側鏈基團的化學修飾：H2O2、光敏試劑、碘代乙酰胺等7、二硫鍵的化學修飾：2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、過甲酸等。8、酚基的化學修飾：N-乙酰咪唑、碘化反應、四硝基甲烷、偶氮化試劑、二異丙基氟磷酸。9、胍基的化學修飾：丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、苯乙二醛等

7、。二、修飾反應的條件：修飾反應應盡量在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破壞酶活性必需基團，修飾率高，活力回收要高。（一）pH與離子強度：pH決定了酶分子中反應基團的解離狀態(tài)，酶的解離狀態(tài)不同，其反應性能也不同；另一方面，有些修飾試劑在不同pH下，與同一種基團反應可以形成不同的產(chǎn)物。離子強度對修飾反應也有重要影響。（二）修飾反應的溫度與時間：嚴格控制反應溫度和時間可以減少或消除一些非專一性的修飾反應。（三）反應體系中酶與修飾劑的比例：酶與修飾試劑的比例可以控制酶分