殼聚糖固定化酶研究進展

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1、殼聚糖直接作為固定化酶載體殼聚糖本身是一種多孔網(wǎng)狀天然高分子粉粒材料,耐熱性好,其分子中的羥基和氨基可形成活潑界面,對蛋白質(zhì)有顯著的親合力,可將酶吸附通過離子鍵、氫鍵及范德華力而與載體結(jié)合。李志國等[4]以殼聚糖為載體,用物理吸附固定化脂肪酶,對影響固定化過程的各種因素進行考察,確定最優(yōu)條件,結(jié)果表明:固定化酶的可操作性優(yōu)于游離酶。以殼聚糖為載體通過吸附制備固定化酶,酶不易失活,但酶與載體之間的結(jié)合力弱,在使用過程中酶分子易從載體上脫落,因此,多數(shù)情況下用吸附—交聯(lián)法以提高其穩(wěn)定性。最常用的交聯(lián)劑是甲醛和戊二醛[5,6],但更多采用戊二醛。吳茜茜等[

2、9]研究了殼聚糖吸附和戊二醛交聯(lián)對脂肪酶固定化的影響。蔡俊等[10]對谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的固定化、游離酶和固定化酶的酶學特性進行了研究,通過試驗確定谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的最佳固定化條件為先用2%殼聚糖吸附酶,然后再加戊二醛交聯(lián),戊二醛濃度1.2%,交聯(lián)時間為16h。王俊等[11]以殼聚糖為載體,采用戊二醛為交聯(lián)劑的方法來固定海藻糖合成酶。趙江等[12]采用殼聚糖吸附和戊二醛交聯(lián)的方法,將胃蛋白酶固定于殼聚糖上?！ぞ厶茄苌镒鳛楣潭ɑ篙d體殼聚糖只能酸溶或溶于酸性水溶液,不能溶于有機溶劑。為了改善它的物理和化學特性可對殼聚糖進行化學修飾,如?；Ⅳ然?、

3、醚化、Schiff反應、N2烷基化、酯化、氧化、鹵化、接枝共聚、絡合等反應,生成一系列具有不同性能的衍生物[28],可用作固定化酶的載體。殼聚糖在甲醇/乙酸介質(zhì)中與過量醛進行Schiff堿反應,可生成醛亞胺化衍生物。魏榮卿等[29]以殼聚糖為載體,與雙醛淀粉反應形成酶柔性固定化模型(Chitosan2DAS50),對木瓜蛋白酶進行柔性固定化,在酶用量為14.4mg/g(酶/干球)、pH8的條件下,固定木瓜蛋白酶18h,所得的固定化酶活力回收率達72%,相當于采用殼聚糖—戊二醛(Chitosan,GA)載體的3倍。雷福厚等[30]將殼聚糖制備成殼聚糖銅

4、高分子絡合物,以配位鍵的形式對多酚氧化酶進行固定化,,過程為:P～NH2+Cu2-—P～NH2Cu2+enzymeP～NH2Cu-enzyme殼聚糖上的-NH2可以與Cu2+形成高分子絡合物。由于高分子鍵的剛性作用,此絡合物的Cu2+配位未飽和,可以進一步與酶中的游離氨基配位,使酶以配位鍵的形式固定在殼聚糖上,此方法稱為高分子配位鍵法。這種方法制備簡單,酶損失少。殼聚糖銅固定化多酚氧化酶在最佳pH值、熱穩(wěn)定性、底物對酶的抑制及米氏常數(shù)等方面均表現(xiàn)出酶催化特征。說明以功能高分子化合物為載體,以Cu2+為配位中心,通過配位橋鍵的形式將酶固定在高聚物上(即

5、高分子配位鍵法)是可行的。宋揚等[31]以殼聚糖微珠為載體,以CuSO4絡合、甲醛改性、表氯醇(32氯21,22環(huán)氧丙烷)和氨水修飾,戊二醛活化,偶聯(lián)牛胰蛋白酶配基,制成抑肽酶親和吸附劑———化學改性與修微球殼聚糖固定化胰蛋白酶。方法過程簡單,樣品酶比活為5700KIU/mg,質(zhì)量穩(wěn)定,成本較低,且該吸附劑機械強度高,抗污染能力較強,非特異性吸附較小,可以反復使用,價格低廉,適合工業(yè)化生產(chǎn)。由于微球殼聚糖載體分子上存在大量游離氨基,化學性質(zhì)極其活潑,表現(xiàn)為pH有緩沖作用,且能與酶催化產(chǎn)物醌反應。為解決上述問題,肖厚榮等[32]先用Cu2+與殼聚糖上的

6、部分氨基絡合,將其保護起來,然后在弱堿性條件下使微球殼聚糖與中性甲醛反應,未絡合的游離氨基及乙酰氨基轉(zhuǎn)變成化學性質(zhì)不活潑的一羥基或二羥基氨基。載體經(jīng)化學修飾,增加反應基團數(shù),從而提高吸附容量和固定化酶單位活力。比較試驗表明:經(jīng)修飾后殼聚糖偶聯(lián)多酚氧化酶比對照高2.3倍。劉崢等[33]以過硫酸鉀/亞硫酸氫鈉為引發(fā)體系制備丙烯腈接枝殼聚糖的共聚物,并以其為載體固定化α2淀粉酶探討固定化酶的最佳制備條件和固定化酶的性質(zhì),并與游離酶殼聚糖作為載體的固定化α2淀粉酶進行了比較,結(jié)果表明:丙烯腈接枝殼聚糖共聚物是固定化α2淀粉酶的優(yōu)良載體。袁春桃等[34]也以接

7、枝共聚物殼聚糖2g2丙烯腈作為載體固定化木瓜蛋白酶,試驗表明:殼聚糖2g2丙烯腈可以較好地吸附、包結(jié)木瓜蛋白酶,固定化酶的酶活力較高,且穩(wěn)定性得到提高。方波等[35]以殼聚糖為原料,采用反相懸浮交聯(lián)的方法制取微球型殼聚糖顆粒,再進行羥丙基氯化及胺基化,制備一系列新型殼聚糖胺基衍生物微球。他在殼聚糖微球的分子結(jié)構(gòu)中分別引入羥丙基和不同種類的胺基,使其結(jié)構(gòu)中胺基含量上升,堿性增強,成為新型殼聚糖胺基衍生物微球,并初步考察其吸附牛血清白蛋白(BSA)性能。方波等[36]還研制了新型殼聚糖胺基衍生物—乙二胺羥丙基殼聚糖(EDA2HPCS),并將其用于固定天門

8、冬酰胺酶。Zhang、Gong等[37]用聚乙二醇(PEG)修飾殼聚糖膜,結(jié)果表明:PEG可改善殼聚糖的性能