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1、總黃酮的測定方法黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的一大類天然產(chǎn)物,種類繁多,大多數(shù)黃酮類化合物與葡萄糖或鼠李糖結(jié)合成苷,部分為游離態(tài)或與鞣質(zhì)結(jié)合存在。黃酮化合物系色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物,一般具有C6-C3-C6的基本骨架結(jié)構(gòu)。近年來,黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用倍受青睞,人們對含有黃酮的化合物進(jìn)行大量研究,以期獲得黃酮含量較高的中草藥。因此黃酮的含量測定成為研究的關(guān)鍵步驟。一、方法（一）高效液相色譜法?1.?原理??植物類樣品用石油醚脫脂后，經(jīng)甲醇加熱回流提取，以高效液相色譜法分離，在紫外檢測器360nm條件下，以保留時(shí)間定性、峰面積定量。2．儀器和試劑?（1）高效液相色譜
2、儀?（2）紫外檢測器??（3）層析柱??（4）超聲波清洗儀?（5）索氏提取器??（6）微孔過濾器（濾膜0.45um）?（7）甲醇（色譜純）?（8）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品?（9）石油醚，鹽酸，磷酸（分析純）。?（10）去離子水?（11）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取經(jīng)105℃干燥恒重的蘆丁標(biāo)誰品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ug／ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液3.?操作步驟（1）樣品處理?1）固體樣品：稱取2.0g干燥的固體樣品，研細(xì)，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，棄去石油醚提取液，剩余物揮去石油醚，加人甲醇50ml和25％HC1?5ml，80℃水浴回流水解1h，
3、取出后快速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，甲醇定容，經(jīng)0.45um濾膜過濾，供分析用。?2）液體樣品：準(zhǔn)確吸取樣品2.0ml，直接以石油醚萃取脫脂，揮去石油醚后，以甲醇溶解并定容，經(jīng)微孔濾膜（0.45um）濾過后供測定用。?（2）色譜分離條件?色譜柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um;?流動(dòng)相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，臨用前用超聲波脫氣；?流??速：lml／min；?柱??溫：40℃；?檢測波長：360nm；?靈敏度：0.02AUFS；?進(jìn)樣量：20ul。?（3）樣品測定：準(zhǔn)確吸取樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)液各10ul，注入高液相色譜儀進(jìn)行分離，以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰
4、的保留時(shí)間定性，以其峰面積計(jì)算出樣品中總黃酮的含量。4、結(jié)果計(jì)算（二）分光光度法1．原理??黃酮類化合物是具有苯并吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的一類天然化合物的總稱，一般都具有4位羰基，且呈現(xiàn)黃色。黃酮類化合物的3—羥基、4—羥基或5—羥基、4－羰基或鄰二位酚羥基，與鋁鹽進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，在堿性條件下生成紅色的絡(luò)合物。?本方法對樣品中黃酮類化合物進(jìn)行提取純化后，用分光光度法于510nm波長下測定其吸光度，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品比較，進(jìn)行待測物中總黃酮的定量測定。2．儀器和試劑?（1）722分光光度計(jì)?（2）索氏提取器?（3）真空泵，鹽基交換管等。?（4）恒溫水浴，分液漏斗。?（5）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品?（6）亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫
5、氧化鈉（分析純）。??（7）氯仿，無水乙醇，甲醇（分析純）。?（8）5％香草醛溶液：稱取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100ml。?（9）聚酰胺樹脂??（10）去離子水。3．操作步驟?（1）樣品處理?1）固體樣品：稱取1～2g干燥的固體樣品，用濾紙包緊，置于索氏提取器中，加入50～100ml?70％乙醇溶液浸潤后，在80℃水浴下回流3h，至提取液無色為止。粗提液冷卻后，減壓抽濾，并用少量25％乙醇溶液洗滌濾渣，合并濾液。在50℃下減壓蒸餾，除去其中的乙醇，直至索氏提取器內(nèi)溶液呈無醇味。倒出容器內(nèi)溶液，用30ml熱水分3次洗滌，抽濾后，將濾液倒入分液漏斗中，以75ml?氯仿分3次萃取脫脂
6、，待完全分層后，收集各次下層水溶液并定容至50ml。?稱取1～2g經(jīng)預(yù)處理的聚酰胺樹脂粉末，濕法裝柱，用水飽和。吸取上述脫脂后的水溶液1～2ml，沿層析柱漫漫滴人柱內(nèi)，放置一定時(shí)間，待測液被充分吸附后，用70％乙醇或甲醇洗脫，流速為1.0ml／min，至流出液基本無色，一般收集10ml即可。上述洗出液用洗脫劑定容后即可用于測定。?2）液體樣品：準(zhǔn)確吸取1.0ml樣品，定容至50ml后，直接以75ml?氯仿分3次萃取脫脂，其余步驟同上。?（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、⒋00ml（相當(dāng)于蘆丁0、75、150、300、450、600ug）
7、，移入10ml刻度比色管中，加入30％乙醇溶液至5ml，各加5％亞硝酸鈉溶液0.3ml，振搖后放置5min，加入10％硝酸鋁溶液0.3ml搖勻后放置6min，加1.0mol／L氫氧化鈉溶液2ml，用30％乙醇定容至刻度。搖勻，放置15min，于510nm波長處測定吸光度，以零管為空白，以蘆丁含量（ug）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r）。?（3）樣品測定：根據(jù)樣品中總黃酮含量高低，取適宜體積待測液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線
