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1、分析人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后骨溶解及假體松動的分子生物【摘要】目的探討人工髖關(guān)節(jié)假體分離出的顆粒碎片刺激巨噬細(xì)胞而釋放的腫瘤壞死因子(TNF-α)在人工髖關(guān)節(jié)術(shù)后引起骨溶解的作用機(jī)理。方法采用鈦顆粒刺激巨噬細(xì)胞而釋放TNF-α模型及酶聯(lián)免疫吸附劑測定、蛋白質(zhì)印跡、凝膠遷移率實(shí)驗方法來研究其生物分子學(xué)機(jī)制。結(jié)果鼠類巨噬細(xì)胞受鈦顆粒刺激而釋放TNF-α，而JNK抑制劑SP600125和NF-кB抑制劑MG132大大抑制了鈦顆粒誘導(dǎo)的TNF-α釋放，但p38抑制劑無此作用，甚至，鈦顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞而激活A(yù)P-1和NF-кB。結(jié)論鈦顆粒誘
2、導(dǎo)的TNF-α釋放與JNK/AP-1及NF-кB通路有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)鈦顆粒骨溶解腫瘤壞死因子【Abstract】ObjectiveTostudythemechanismofosteolysisaftertotalhipreplacementbytumornecrosisfactor-α(TNF-α)releaseinmacrophagesstimulatedprosthesis.MethodsAmodelofTNF-αreleasebystimulatingmacrophagesparticlesadeand
3、studythemechanismofTNF-αreleasebyElisa/SA.ResultsTNF-αurinemacrophagestimulatedbytitanium(Ti)particlesandspecificinhibitorsofJNK(SP600125)andNF-κB(MG132),butnotp38(SB203580)dramaticallyinhibitedTi-stimulatedTNF-αrelease.Moreover,transcriptionalactivationofAP-1andNF
4、-κBonstratethatTiparticle-inducedTNF-αreleaseismediatedthroughJNK/AP-1asble等已證明TNF-α可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞NF-кB配位子（RANKLE）受體及巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(M-CSF)受體活性［5］。而且，Ingham等發(fā)現(xiàn)TNF-α又直接促進(jìn)早破骨細(xì)胞分化并激活成熟的破骨細(xì)胞吸收骨組織［6］。與此同時,Merkel等通過去除腫瘤壞死因子受體（TNFR）基因的動物顱骨與PMMA顆粒接觸，發(fā)現(xiàn)無骨溶解現(xiàn)象［7］。這些結(jié)果顯示，TNF-α是人工關(guān)節(jié)術(shù)后磨損
5、顆粒導(dǎo)致的骨溶解重要細(xì)胞因子。但至今,尚未報告與此相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制。本次實(shí)驗,通過鼠巨噬細(xì)胞受鈦顆粒刺激而釋放的TNF-α模型來分析TNF-α合成的分子生物學(xué)機(jī)制。1材料與方法1.1材料DMEM培養(yǎng)基，牛胎血清（FBS）來自于GibcoInvitrogen公司（Rockville.MD）。PD98059、SP600125、MG132來自于Calbiochem(LaJolaCA)?？沽姿?ERK/JNK/IkBα抗體來自于CellSignalingTechnology(Beverly,MA)。測定鼠TNF-αELISA試劑
6、盒來自于BioSourceinternational(MadisonO)。硝基纖維膜及化學(xué)法光試劑盒來自于AmershanBiosciencesCorperation(Piscataa公司。1.2細(xì)胞培養(yǎng)RAEM培養(yǎng)基以及5％CO2濕潤的37°C空氣中，等生長到60%～70%后計數(shù)并培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)皿（2×104細(xì)胞/孔）或60mm組織培養(yǎng)皿(2×106細(xì)胞皿)，然后，細(xì)胞與已知濃度的PD98059、SP600125、MG132處理30min后，再與鈦顆粒處理。上清液及細(xì)胞收集后用于進(jìn)一步分析。1.3鈦顆粒準(zhǔn)備鈦顆粒（1～3
7、μm）來自于Cerac(MilulusAmebocyteLysate方法（Biol以后再倍比稀釋至78pg/ml，即：10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml、78pg/ml。洗板3次，加入稀釋好的酶標(biāo)抗體，100μl/孔，37℃，1h。洗板3次，加入配好的ABTS顯色液，100μl/孔，室溫或37℃顯色15～30min。ELISA讀數(shù)儀測450nm/650nm處OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.4.2mol/LNaCl、1NP-40、0.5去氧膽酸及5
8、0mmol/LTris-HCl,pH8.0)中，室溫下1h，離心10min(13000r/min)，取上清液，檢測蛋白濃度。將同一蛋白濃度的待測標(biāo)本、陽性對照及陰性對照樣本煮沸3min，分別加入4%～15%十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠，電泳45～60min(電壓200V)。將帶有蛋白帶的
