基于1h nmr 代謝組學(xué)的陽明經(jīng)穴特異性研究

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1、基于1HNMR代謝組學(xué)的陽明經(jīng)穴特異性研究：吳巧鳳，徐世珍，余曙光，顏賢忠，唐勇，劉娟，毛森，周思遠(yuǎn)，梁繁榮【摘要】目的采用基于核磁共振(1Hnuclearmagicresonance，1HNMR)和模式識(shí)別技術(shù)的代謝組學(xué)方法分別觀察針刺陽明經(jīng)穴與他經(jīng)穴位對(duì)健康男性尿液代謝產(chǎn)物的影響，從針刺對(duì)機(jī)體代謝流影響的角度探討陽明經(jīng)穴的特異性。方法60例健康青年男性隨機(jī)分為足三里組，梁門組，巨髎組，陽陵泉組，委中組和空白對(duì)照組，每組10例。分別針刺相應(yīng)穴位，連續(xù)針刺5d，獲取受試者晨尿，采用1HNMR檢測(cè)尿液代謝物

2、，運(yùn)用主成分分析和正交偏最小二乘判別分析等模式識(shí)別方法分析所得數(shù)據(jù)。結(jié)果針刺陽明經(jīng)穴對(duì)機(jī)體尿液代謝物的影響基本一致，均可以升高尿液中馬尿酸和氧化三甲胺的含量，降低甘氨酸含量;針刺陽明經(jīng)穴與針刺陽陵泉對(duì)尿液代謝物的影響差別不大，但與針刺委中后的差別明顯;針刺委中后尿液代謝物中肌酐明顯升高。結(jié)論對(duì)尿液代謝物的模式識(shí)別分析顯示，陽明經(jīng)穴具有一定的共性，但與陽陵泉的差別不明顯，與委中的差別較為明顯，有關(guān)原因尚需進(jìn)一步深入研究?！娟P(guān)鍵詞】針灸;經(jīng)穴特異性;陽明經(jīng);代謝組學(xué)　經(jīng)穴特異性理論是闡明經(jīng)穴功能和指導(dǎo)針灸臨床

3、治療的重要基礎(chǔ)，也是發(fā)展經(jīng)絡(luò)理論、評(píng)價(jià)針灸療效的重大選題[1，2]。本研究從整體代謝流的角度，采用目前系統(tǒng)生物學(xué)中以觀察復(fù)雜系統(tǒng)終端產(chǎn)物為代表的代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法，對(duì)針刺陽明經(jīng)和他經(jīng)穴位后機(jī)體尿液代謝物進(jìn)行分析，從針刺對(duì)機(jī)體代謝流影響的角度探討陽明經(jīng)的特異性，為經(jīng)穴特異性研究提供新的生物信息學(xué)依據(jù)，為代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法在經(jīng)穴特異性這一新領(lǐng)域的應(yīng)用提供借鑒?！　?研究對(duì)象　　受試者均為男性健康志愿者，漢族，年齡20～25歲，體質(zhì)量指數(shù)18～24。經(jīng)檢查受試者無糖尿病、柯興氏綜合征、甲

4、狀腺功能低下、性腺功能低下等代謝功能異常，無心腦血管疾病，無肝、腎功能不全或重要器官功能障礙，無精神疾患，無吸煙、嗜酒等不良嗜好。共收集60例受試者，隨機(jī)分為6個(gè)組，分別為足三里組，梁門組，巨髎組，陽陵泉組，委中組，和空白對(duì)照組，每組10例?！　?方法　　2.1穴位治療試驗(yàn)前所有受試者接受標(biāo)準(zhǔn)化飲食1周，忌辛辣刺激飲食，避免劇烈運(yùn)動(dòng)。受試者每日固定時(shí)間接受針刺治療，分別針刺相應(yīng)的穴位并得氣后，在相應(yīng)穴位附近旁開0.5cm處再淺刺一針，不得氣，作為輔助電極，連接G6805II電針儀，采用疏密波，頻率為16次

5、/min，電壓220V，逐漸加大電流至能耐受為度(有明顯的震顫感，但又不過分強(qiáng)烈)。1次/d，30min/次，連續(xù)針刺5d。空白對(duì)照組不給予任何針刺刺激。針刺全部結(jié)束后第2天收集受試者晨尿，10000r/min離心10min，獲取尿液上清樣本?！　?.21HNMR數(shù)據(jù)采集和分析取350μl的尿液，分別加入30μl的TSP/D2O(1mg/ml)，350μl磷酸緩沖溶液，充分振蕩混勻后，13000r/min離心10min。取600μl上清加入5mm核磁共振管中混勻，待用。樣本分別進(jìn)行1H-NMR實(shí)驗(yàn)。采用有

6、預(yù)飽和的1DNOESY脈沖序列，取如下參數(shù)：譜寬8000Hz，混合時(shí)間0.15s，馳豫延遲時(shí)間2s，采樣點(diǎn)數(shù)32k，累加次數(shù)64次;在馳豫延遲和混合期間采用預(yù)飽和方式抑制水峰，譜儀偏置設(shè)置在水峰的位置。FID信號(hào)經(jīng)過填零為64k點(diǎn)之后，再加上0.5Hz的線增寬因子，經(jīng)傅立葉變換轉(zhuǎn)換為NMR圖譜。以TSP為化學(xué)位移參考峰的位置，并定為δ0。對(duì)所得NMR數(shù)據(jù)經(jīng)傅立葉變換得到譜圖，經(jīng)相位校正和基線校正之后，對(duì)一定區(qū)間內(nèi)的譜圖按每段0.04ppm的寬度進(jìn)行分段積分，同時(shí)排除包含溶劑峰和尿素峰的部分(δ4.6～6.

7、2)。其中NOESY數(shù)據(jù)積分范圍為δ0.4～9.4。將積分按每張譜的總積分強(qiáng)度歸一化。所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到Excel文件保存?！　?.3模式識(shí)別分析將保存的Excel格式數(shù)據(jù)輸入到SIMCA-P+軟件(v10.04，Umetrics，Ume，Sweden)進(jìn)行模式識(shí)別分析。數(shù)據(jù)采用Pareto標(biāo)度化(Paretoscaling)進(jìn)行預(yù)處理之后;再采用正交信號(hào)校正(OSC，orthogonalsignalcorrection)濾噪，然后再進(jìn)行PCA和PLS-DA分析。分析結(jié)果以得分圖(scoresplot

8、)和載荷圖(loadingsplot)的形式表示?！　?結(jié)果　　3.1針刺陽明經(jīng)穴對(duì)機(jī)體尿液代謝的影響分別針刺足三里，梁門和巨髎后機(jī)體尿液代謝物的改變?nèi)鐖D1a所示。結(jié)果顯示3個(gè)組在得分圖上均分布于PC1的2SD范圍內(nèi)，即各組經(jīng)模式識(shí)別后分離趨勢(shì)不明顯。表明針刺這3個(gè)穴位對(duì)機(jī)體的尿液代謝影響效果較為一致。但與空白對(duì)照組相比，針刺陽明經(jīng)穴后尿液代謝物明顯不同(圖1b)，模式識(shí)別后與空白對(duì)照組分布于不同區(qū)域，陽明經(jīng)穴各組主要分布于得