western blotting protocol

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1、WesternBlot原理WesternBlot（WB）是通過聚丙烯酰胺電泳根據(jù)分子量大小分離蛋白后轉(zhuǎn)移到雜交膜上，然后通過一抗/二抗復(fù)合物對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性檢測的方法。WesternBlot流程圖聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）轉(zhuǎn)膜封閉洗膜（3×5mins）孵育一抗（4度過夜或室溫4-6小時(shí)）洗膜（3×10mins）孵育二抗（室溫2小時(shí)）洗膜（3×10mins）顯影SDS-PAGE分離蛋白的原理和操作一.形成和結(jié)構(gòu)聚丙烯酰胺凝膠電泳是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)試劑N-N’-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和增速劑的情況下聚合而成。丙烯酰胺的單體形成長鏈，由N-N’-甲叉雙丙烯酰胺的功能基團(tuán)和鏈末端的功

2、能基團(tuán)反應(yīng)而交聯(lián)。通常丙烯酰胺的聚合有兩種.81.化學(xué)聚合常用過硫酸銨，過硫酸鉀來引發(fā)這個(gè)過程，用TEMED，三乙醇胺作為加速劑，這種引發(fā)-增速的催化系統(tǒng)是氧化-還愿過程。當(dāng)TEMED溶液中加入過硫酸銨后，過硫酸銨產(chǎn)生自由基，而丙烯酰胺和自由基作用活化，活化的烯酰胺形成多聚長鏈。2.光聚合光聚合的催化劑是核黃素，在紫外線作用下，核黃素生成含自由基的產(chǎn)物，丙烯酰胺和自由基作用活化，活化的烯酰胺形成多聚長鏈。我們實(shí)驗(yàn)室采用的是化學(xué)聚合的方法。二.作用原理聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，它有兩種形式，一種是非變性聚丙烯酰胺凝膠，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開.蛋

3、白大小，形狀和電荷。而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個(gè)技術(shù)首先是1967年由shapiro建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇(DTT)能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的蛋白量，這樣就消除了

4、不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，與連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。1.濃縮膠濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電級(jí)液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動(dòng)，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅

5、速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。2.分離膠8分離膠孔徑較小，通過選擇合適的凝膠濃度，可以使樣品很好的分離。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠，PH，凝膠孔徑改變，使慢離子的涌動(dòng)率變大，超過蛋白，高強(qiáng)度電場消失。因此蛋白在均一的PH，和電場強(qiáng)度下通過分離膠。如果蛋白分子量不同，通過分離膠受到的摩擦力不同，涌動(dòng)率也不同，因此能夠根據(jù)蛋白的分子量不同而分開。三.常用參數(shù)聚丙烯酰胺的特性，包括機(jī)械性能，彈性，透明度，孔徑大小取決于T，C，T是兩個(gè)單體(單體丙烯酰胺和N-N’-甲叉雙丙烯酰胺)的總百分濃度，C是與總濃度有關(guān)的交聯(lián)百分比濃度。T=(a+b)/mC=b/(a+b)（a為單體

6、丙烯酰胺的克數(shù)，b為N-N’-甲叉雙丙烯酰胺的克數(shù)，m為緩沖液終體積）a，b的比例很關(guān)鍵，如果a.b小于10，膠脆，硬。如果a.b大于100，膠糊狀。一般有彈性，透明的膠，a.b比例應(yīng)在30。一般的膠聯(lián)度是隨著T的增加而降低的，在5%-20%交聯(lián)度的公式C=6.5-0.3T而T是根據(jù)分離物質(zhì)的分子量大小決定，因?yàn)榈鞍自诓煌瑵舛饶z的遷移率，是隨總濃度的增加而降低的。因此在分離不同分子量的混合物時(shí)，要選適宜濃度的凝膠。一般SDS-PAGE的有效分離范圍如下表.表1SDS-PAGE的線性分離范圍丙烯酰胺濃度（％）線性分離范圍（kD）1512~431016~687.536~945.057~212四.

7、常見問題及解決辦法.1.紋理和拖尾現(xiàn)象.由于樣品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。2.蛋白帶過寬，與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多，可以減少上樣量。3.電泳時(shí)間比正常要長?？赡苡捎谀z緩沖系統(tǒng)和電級(jí)緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯(cuò)誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。84.指示劑成微笑符號(hào)（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形），說明凝膠