western blotting 綜述

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1、WesternBlotting定義:免疫印跡是一個(gè)用于蛋白質(zhì)分析的常規(guī)技術(shù)，在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持物，然后利用抗原-抗體的特異性反應(yīng)，從蛋白混合物中檢測(cè)出目標(biāo)蛋白，從而定量或定性的確定正?；?qū)嶒?yàn)條件下細(xì)胞或組織中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。westernblot是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。特點(diǎn):WesternBlot結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。

2、組成:典型的印跡實(shí)驗(yàn)包括三個(gè)步驟①蛋白質(zhì)的電泳分離；②將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固體膜上，用非特異性，非反應(yīng)活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域；③免疫學(xué)檢測(cè)。免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進(jìn)行免疫學(xué)分析的弊端，極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度，使其成為使用最廣泛的免疫化學(xué)方法之一。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移，它又有半干法和濕法之分，現(xiàn)在大多用濕法。第三步

3、是用特異性的抗體檢測(cè)出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測(cè)的方法可以是直接的和間接的。現(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)的方法，在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體（堿性磷酸酶（AP）或辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗第一抗體的抗體）雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過(guò)膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來(lái)顯示抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)中?；驹硪约安僮鞯谝徊糠郑篠DS-PAGE電泳1、電泳樣品的制備---蛋白質(zhì)的變性.蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的PH值下表現(xiàn)出不同的電荷，為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有

4、關(guān)，我們?cè)谏蠘忧?，通常?huì)進(jìn)行一些處理(上樣緩沖液)。即在樣品中加入含有SDS和β-巰基乙醇的上緩沖液。SDS即十二烷基磺酸鈉（CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+），是一種陰離子表面活性劑，它可以斷開(kāi)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；β-巰基乙醇是強(qiáng)還原劑，它可以斷開(kāi)半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。電泳樣品加入樣品處理液后，經(jīng)過(guò)高溫處理，其目的是將SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)同時(shí)使整個(gè)蛋白帶上負(fù)電荷；另外樣品處理液中通常還加入溴酚藍(lán)染料，溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子，可以自由通過(guò)凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的

5、前沿位置，當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)，即可停止電泳。用于監(jiān)控整個(gè)電泳過(guò)程；另外樣品處理液中還加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時(shí)樣品溶液可以快速沉入樣品凹槽底部。當(dāng)樣品上樣并接通兩極間電流后(電泳槽的上方為負(fù)極，下方為正極)，在凝膠中形成移動(dòng)界面并帶動(dòng)凝膠中所含SDS負(fù)電荷的多肽復(fù)合物向正極推進(jìn)。樣品首先通過(guò)高度多孔性的濃縮膠，使樣品中所含SDS多肽復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱(chēng)積層）。2、凝膠制備以及電泳2.1SDS-PAGE凝膠配制配制相應(yīng)濃度的SDS-PAGE分離膠，TEMED加入后迅速混勻制膠，沿壁迅速灌注分離膠溶液，留出積層膠所需空間（梳

6、齒長(zhǎng)再加1cm）。覆蓋5mm水(或異丙醇）層于分離膠溶液上，約30-60min后分離膠和水層之間會(huì)出現(xiàn)清晰界面，表明分離膠充分聚合（可微微傾斜模具，檢測(cè)凝膠是否聚合）。ddH2O輕輕洗滌凝膠頂部數(shù)次，以除去未聚合的凝膠，再用濾紙吸凈殘留液體，注意不要接觸膠面。覆蓋層可保持膠面平整和防止空氣進(jìn)入，因?yàn)檠鯕鈹U(kuò)散進(jìn)入凝膠會(huì)抑制聚合反應(yīng)。灌膠時(shí)開(kāi)始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。膠濃度＜10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS

7、。封膠后切記，勿動(dòng)。配制相應(yīng)體積的積層膠液體，在已聚合分離膠上直接灌注積層膠液體，立即插入加樣梳，并在空隙處補(bǔ)足積層液液體（小心避免混入氣泡），室溫靜置30～60min至完全聚合，將凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽加入Tris甘氨酸電泳緩沖液，至少要淹沒(méi)加樣孔。小心拔出加樣梳，避免損壞加樣孔，如加樣孔有氣泡，可向其中加入適量電泳緩沖液將氣泡驅(qū)除；若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正。凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，要特別注意幾點(diǎn)：凝膠要均一沒(méi)有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過(guò)多，太多會(huì)導(dǎo)致膠易脆裂；拔梳子時(shí)要快，盡量保證點(diǎn)樣孔平整。2