酶聯(lián)免疫精品醫(yī)學(xué)ppt課件

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1、核酸和蛋白質(zhì)分析技術(shù)第一節(jié)核酸分析技術(shù)講述內(nèi)容:1、核酸電泳2、雜交技術(shù)3、PCR技術(shù)4、基因芯片一、核酸電泳(一)DNA的凝膠電泳凝膠電泳是分子克隆的中心技術(shù)之一。1.瓊脂糖凝膠用于分離大于200~1000bp的片段;操作簡單、快速,且分離范圍廣,分辨率高2.聚丙烯酰胺凝膠用于分離5-500bp的片段;效果好、分辨率極高,相差1bp的DNA片斷就能分開,能容納相對大量的DNA用于核苷酸多態(tài)性的分析瓊脂糖凝膠電泳的基本過程材料:電泳緩沖液(常用TAE或TBE)、電泳級瓊脂糖、溴化乙錠溶液(核酸顯

2、示劑)、加樣緩沖液(保證核酸不在加樣孔中擴(kuò)散和用于電泳時間的指示系統(tǒng))、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)?;具^程:制膠放入電泳槽中并加入電泳緩沖液取出梳子將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中一定電壓條件下電泳合適的時間后停止電泳取出凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果注意:溴化乙錠具有致癌性,操作時要帶手套不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度(%,W/V)DNA分子的有效分離范圍(kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-

3、32.00.1-2影響DNA在凝膠中遷移速率的因素:1DNA分子的大小2構(gòu)象3凝膠濃度4電壓5緩沖液瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡過程中DNALadder的形成PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳聚丙烯凝膠電泳的銀染結(jié)果分析特殊的凝膠電泳倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳(FIGE):用于分離分子量10~2000kb的DNA分子;鉗位均勻電場電泳(CHEF電泳):可分離大于107bp的DNA分子基本過程同DNA電泳一樣,但應(yīng)明確一點(diǎn)的是,因?yàn)镽NA分子對RNA酶的作用非常敏感,因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液

4、,所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解;另外,因?yàn)镽NA分子有二、三級結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果,因此電泳時應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行,常用的變性劑為甲醛和戊二醛。(二)RNA電泳二核酸雜交技術(shù)(一)SouthernBlot原理:將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后,通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上,固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列,則二者通過

5、堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合,游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測,從而顯示出待檢的片段及其相對大小。用途:檢測樣品中的DNA及其含量,了解基因的狀態(tài),如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。SouthernBlot操作步驟:DNA瓊脂糖電泳印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交(變性探針)洗膜放射自顯影或顯色原理:在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,繼而按照同SouthernBlot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。用途:檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)及其含量。(二)NorthernBl

6、ot操作過程mRNA提取甲醛變性電泳印跡轉(zhuǎn)移預(yù)雜交雜交(變性探針)洗膜放射自顯影或化學(xué)發(fā)光(三)探針標(biāo)記技術(shù)1標(biāo)記物:放射性和非放射性兩種放射性:非放射性:生物素、地高辛素、熒光素2、標(biāo)記方法(1)切口平移法(2)隨機(jī)引物法(3)末端標(biāo)記法(4)單鏈DNA探針標(biāo)記(5)寡核苷酸探針標(biāo)記法32P、35S和3H三PCR技術(shù)PCR(Polymerasechainreaction)是用一對寡聚DNA作為引物,通過加溫變性-退火-DNA合成這一周期的多次循環(huán),使目的DNA片段得到擴(kuò)增。由于這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以

7、指數(shù)形式積累的,經(jīng)25-30個循環(huán)后,擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106。Dr.KarryMullis1985年發(fā)明,獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎;目的:用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。(一)原理:雙鏈DNA通過高溫變性解離成互補(bǔ)單鏈DNA---變性↓與一對寡核苷酸引物(5’,3’)降低溫度退火DNA加熱變性+引物慢慢冷卻使其結(jié)合,形象地稱為退火↓適溫延伸5’/3’引物形成新鏈變成4條鏈DNA--延伸↓第二輪:變性—退火—延伸呈指數(shù)增長理論值:一輪一倍10輪103=1000倍20輪10630輪109理論

8、模板擴(kuò)增30輪1ng-----------1g實(shí)際模板擴(kuò)增30輪1ng-----------10?g1TaqDNA聚合酶:水生棲熱菌(thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶①5’?3’DNA聚合酶活性;②無3’?5’外切酶活性,35輪0.25%錯配,與原始模板有差別;最適聚合酶溫度72℃,選擇72℃延伸半衰期:92.5℃130min95℃40min97.5℃5—6min變性溫度:≤95℃使其在整個擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性(二)基本要素pfuDNA聚合酶耐熱5’?3’DNA聚合酶活

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