《酶聯(lián)免疫分析法》ppt課件

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1、第七章酶聯(lián)免疫分析法第七章酶聯(lián)免疫分析法基本要求：了解免疫分析發(fā)展史，掌握抗原、抗體和免疫反應(yīng)的原理，了解免疫分析法的分類，熟悉酶標(biāo)記免疫分析法中使用的酶，熟悉ELISA的原理，掌握ELISA的固相載體、包被與封閉、稀釋液、洗滌液、酶反應(yīng)終止液及ELISA法常用酶的底物系統(tǒng)，掌握ELISA的酶聯(lián)方法和試驗(yàn)方法，熟悉ELISA反應(yīng)條件的選擇，掌握ELISA的定量計(jì)算，了解ELISA的靈敏度提高途徑，熟悉ELISA放大系統(tǒng)。了解化學(xué)發(fā)光分析的原理，熟悉化學(xué)發(fā)光劑的種類，熟悉化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的標(biāo)記酶和發(fā)光增強(qiáng)劑，熟悉生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的生物發(fā)光反應(yīng)體系。第七章酶聯(lián)免疫分析法第

2、一節(jié)酶聯(lián)免疫分析概述第二節(jié)光度酶聯(lián)免疫分析第三節(jié)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析第一節(jié)酶聯(lián)免疫分析概述一、免疫分析1、免疫分析發(fā)展史免疫分析（Immunoassay，IA）是利用待測物質(zhì)（抗原或抗體）與其相對(duì)應(yīng)物質(zhì)（抗體或抗原）之間專一特異性反應(yīng)而建立起來的一種高選擇性分析方法。免疫分析主要基于用抗體（或抗原）作為選擇性化學(xué)試劑以分析測定抗原（或抗體）及半抗原。宋代人工痘苗預(yù)防烈性傳染病天花1971年第一屆國際免疫學(xué)會(huì)議將免疫學(xué)與微生物學(xué)分開發(fā)展成一門獨(dú)立的學(xué)科。“免疫（immunity）”一詞源于“immunitas”，原意是免除稅賦和差役。研究早期免疫學(xué)多集中在抗體抗感染能力研究。20世紀(jì)中期以

3、后，人們逐漸開始對(duì)各種抗原、微生物的作用進(jìn)行研究，發(fā)展出基礎(chǔ)免疫學(xué)、臨床免疫學(xué)、免疫學(xué)檢測、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)等多個(gè)分支?，F(xiàn)代免疫學(xué)將“免疫”定義為：機(jī)體對(duì)“自己”和“異己”識(shí)別、應(yīng)答過程中所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)的總和，正常情況下是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種生理性功能。第一節(jié)酶聯(lián)免疫分析概述2、抗原、抗體與免疫反應(yīng)抗原是能夠引起免疫反應(yīng)的分子。免疫原性（immunogenicity）指誘導(dǎo)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。具有免疫原性的物質(zhì)稱為免疫原（immunogen）。免疫反應(yīng)原性（immunoreactivity）或抗原性（antigenicity），指能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異

4、性結(jié)合，引起免疫反應(yīng)的性能。具備上述兩種特性的物質(zhì)為完全抗原，僅具有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)被稱為半抗原（hapten）。第一節(jié)酶聯(lián)免疫分析概述抗體是能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。所有的抗體都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗體。例如無免疫活性的免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不是抗體，盡管其結(jié)構(gòu)與抗體相似?？贵w主要存在于血清內(nèi)，但在其他體液及外分泌液中也有存在。抗原抗體分子之間存在著結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性和親和性，使得抗原與相應(yīng)抗體之間極易發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，這種反應(yīng)具有高特異性（即專一性）和可逆性。第一節(jié)酶聯(lián)免疫分析概述抗原、抗體發(fā)生如下免疫反應(yīng)：Ag+AbAg-Ab該免疫反應(yīng)遵循可逆生物大分子

5、相互作用的熱動(dòng)力學(xué)基本原理，其反應(yīng)式為式中：[Ab]為游離的抗體結(jié)合位點(diǎn)的濃度；[Ag]為游離的抗原結(jié)合位點(diǎn)的濃度；[Ab-Ag]為抗原-抗體復(fù)合物的濃度；k1為正反應(yīng)速率常數(shù)；k2為負(fù)反應(yīng)速率常數(shù)；K為反應(yīng)平衡常數(shù)（親和常數(shù)）。第一節(jié)酶聯(lián)免疫分析概述這種抗原-抗體反應(yīng)既可發(fā)生于體內(nèi)（invivo），也可發(fā)生于體外（invitro）?？贵w主要存在于血清中，在抗原、抗體的檢測中多采用血清做試驗(yàn)，所以體外抗原-抗體反應(yīng)也稱為血清學(xué)反應(yīng)（serologicreaction）。基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測技術(shù)主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面：①用已知抗原檢測未知抗體；②用已知抗體檢測未知抗原；③定性或定量

6、檢測體內(nèi)各種大分子物質(zhì)；④用已知抗體檢測某些藥物、激素等各種半抗原物質(zhì)。第一節(jié)酶聯(lián)免疫分析概述二、酶標(biāo)記免疫分析法及常用標(biāo)記酶1、免疫分析法分類免疫分析標(biāo)記免疫分析放射免疫分析法化學(xué)發(fā)光免疫分析法電化學(xué)免疫分析法熒光免疫分析法酶聯(lián)免疫分析法競爭性酶聯(lián)免疫分析非競爭性酶聯(lián)免疫分析均相酶聯(lián)免疫分析非均相酶聯(lián)免疫分析非標(biāo)記免疫分析沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、免疫電泳、免疫擴(kuò)散第一節(jié)酶聯(lián)免疫分析概述2、酶標(biāo)記免疫分析法中使用的酶（1）酶聯(lián)免疫分析中使用的酶應(yīng)符合下列條件：①純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化速率高、專一性強(qiáng)；②具有足夠的偶聯(lián)用標(biāo)記基團(tuán)，與抗原、抗體蛋白分子偶聯(lián)后仍保持較高的催化活性；③使用穩(wěn)定性

7、和保存穩(wěn)定性好；④測定酶活性的方法簡便、靈敏、快速；⑤待測體液中不存在與標(biāo)記酶相同的酶；第一節(jié)酶聯(lián)免疫分析概述⑥待測溶液中應(yīng)該無底物、反應(yīng)抑制劑和其他與酶發(fā)生反應(yīng)的干擾物質(zhì)；⑦酶的來源、純化和供應(yīng)較方便，價(jià)格較低廉；⑧均相酶免疫測定法中使用的酶，還要求當(dāng)抗體與半抗原-酶結(jié)合物結(jié)合后，酶活性表現(xiàn)出抑制或激活。第一節(jié)酶聯(lián)免疫分析概述（2）酶的評(píng)價(jià)指標(biāo)通常用RZ和酶的比活力評(píng)價(jià)標(biāo)記酶的質(zhì)量。RZ表示酶蛋白中活性部分與非活性部分最大吸光度的比值。酶的比活力指在特定