nyt 2050-2011 玉米霜霉病菌檢疫檢測與鑒定方法

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1、ICS65.02fJB15中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T2050—2011玉米霜霉病菌檢疫檢測與鑒定方法DetectionandidentificationofPeronosclerosporaspp.2011-09-01發(fā)布2011-12-01實施中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布NY/T2050—2011前言本標準按照GB／T1.1——2009給出的規(guī)則起草。本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司提出。本標準由全國植物檢疫標準化技術(shù)委員會(SAC／TC271)歸口。本標準起草單位：全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、廣西壯族自治區(qū)植?？傉?。

2、本標準主要起草人：王福祥、王凱學、覃貴亮、吳志紅、鄧鐵軍、李瀟楠、李菁、沈昆、朱莉。ⅠNY/T2050—2011玉米霜霉病菌檢疫檢測與鑒定方法1范圍本標準規(guī)定了玉米霜霉病菌的現(xiàn)場檢驗及室內(nèi)鑒定的方法。本標準適用于玉米、甘蔗、高粱等禾本科植物上玉米霜霉病菌的檢疫檢測與鑒定。2原理玉米霜霉病主要由玉蜀黍霜指霉（Peronosclerosporamaydis）、高梁霜指霉（Psorghi）、菲律賓霜指霉(P.philippinensis)和甘蔗霜指霉（P．sacchari）引起，該類菌（以下簡稱玉米霜霉病菌Peronoscle-rosp

3、oraspp.）屬于卵菌綱(Oomycetes)，指梗霉目(Sclerosporales)，指梗霉科(Sclerosporaceae)，霜指霉屬(Peronosclerospora)。該病菌都是專性寄生在禾本科植物上(參見附錄A)，可侵染玉米的葉片和莖稈造成系統(tǒng)和局部癥狀。這4種病菌引起的玉米霜霉病有明顯的癥狀，病原菌有其獨特的形態(tài)特征，用特異引物對病菌DNA進行PCR擴增時可獲得特異的DNA片段。病害的癥狀、病原菌的形態(tài)特性以及PCR特異反應(yīng)特征是鑒定玉米霜霉病菌的主要依據(jù)。3試劑與材料棉藍乳酚油、吐溫-20、乙醇、11.5%N

4、aOH、0.015%TrypaneBlue、乳酸、甘油、10倍PCR緩沖液、玉米霜霉病菌DNA的特異性引物、dNTP、Taq酶、5倍TBE電泳緩沖液、瓊脂糖凝膠(0.8%)、吸水紙、無菌水、蒸餾水，1000bpDNAladder等。4儀器及用具蓋玻片、載玻片、生物顯微鏡、高速臺式離心機、PCR擴增儀、天平、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR反應(yīng)管、微量移液器、移液器、解剖刀、培養(yǎng)皿、燒杯、漏斗、鑷子、分樣篩(5mm、4mm、3mm)、吸管等。5現(xiàn)場檢測5.1產(chǎn)地檢測在寄主大田作物生長期逐行進行田間癥狀目測踏查

5、。按要求采集有典型癥狀和疑似癥狀的玉米霜霉病樣本進行室內(nèi)檢驗鑒定。玉米霜霉病典型癥狀參見附錄B。5.2調(diào)運檢測現(xiàn)場核實貨物有關(guān)單證,核實產(chǎn)地。重點檢查來自玉米霜霉病菌發(fā)生區(qū)的其寄主種子或原糧中是否夾帶玉米、高粱、甘蔗等葉片病殘體，是否夾帶穎殼的高粱種子；帶玉米、高梁植株殘體的包裝、鋪墊材料，以及甘蔗插條和其他玉米霜霉病菌寄主種苗葉片是否有可疑病斑，將檢獲物帶回實驗室作進一步檢驗。6室內(nèi)檢測6.1寄主葉片等病殘體檢測6.1.1直接鏡檢檢測如果寄主葉片上有白色霜霉狀物，可直接挑取白色霜霉或撕取帶有白色霜霉的病組織制成玻片樣品在顯微鏡下

6、觀察病原菌的孢囊梗和孢子囊形態(tài)。如果染色觀察，加1滴棉藍乳酚油染色后立即用無1NY/T2050—2011菌水沖洗，然后用吸水紙吸干多余的染色液，加上蓋玻片在顯微鏡下鏡檢。對藏卵器和卵孢子的觀察需采集病葉褐色壞死部位。用鑷子取小片病組織,放在載玻片上，加一滴無菌水，用尖頭鑷子撥開葉肉，放在顯微鏡下觀察葉肉中的藏卵器和卵孢子。病原菌形態(tài)特征參見附錄C。6.1.2保濕培養(yǎng)檢測如果可疑病葉未見有白色霜霉狀物,可將病葉切段后分別放在培養(yǎng)皿中用吸水紙保濕,然后置于恒溫培養(yǎng)箱并在黑暗中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為21℃，相對濕度為100%，5h后每隔0.

7、5h觀察1次，連續(xù)觀察6h，觀察孢囊梗及孢子囊的形成、孢子囊萌發(fā)長出芽管的過程。觀察方法同6.1.1。對于田間有白色霜霉狀物的寄主病葉，需收集孢子囊置于18℃、100%相對濕度的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，1h～2h后觀察其萌發(fā)情況。6.2種子檢測系統(tǒng)發(fā)病的玉米霜霉病病株的成熟種子內(nèi)部含有菌絲，種子穎殼、種皮表面可能帶有卵孢子，可采用以下方法確定種子是否被病菌感染。6.2.1洗滌檢測從樣品中隨機取種子100粒,浸入25mL蒸餾水中（加入l滴吐溫），振蕩10min，取懸浮液，用離心機離心10min(2000g)，棄去上清液，沉淀物用2mL蒸餾

8、水懸浮，鏡檢至少8滴～10滴懸浮液，觀察是否有卵孢子。病原菌形態(tài)特征參見附錄C。6.2.2透明染色檢測從樣品中隨機取種子400粒，在室溫下浸入11.5%NaOH和0.015%TrypaneBlue溶液中24h。浸泡后的種子在自來水中沖洗攪動,然后用