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《NYT2050-2011 玉米霜霉病菌檢疫檢測(cè)與鑒定方法.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、ICS65.02fJB15中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T2050—2011玉米霜霉病菌檢疫檢測(cè)與鑒定方法DetectionandidentificationofPeronosclerosporaspp.2011-09-01發(fā)布2011-12-01實(shí)施中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布NY/T2050—2011前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB／T1.1——2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC／TC271)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、
2、廣西壯族自治區(qū)植?？傉?。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王福祥、王凱學(xué)、覃貴亮、吳志紅、鄧鐵軍、李瀟楠、李菁、沈昆、朱莉。ⅠNY/T2050—2011玉米霜霉病菌檢疫檢測(cè)與鑒定方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了玉米霜霉病菌的現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)及室內(nèi)鑒定的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米、甘蔗、高粱等禾本科植物上玉米霜霉病菌的檢疫檢測(cè)與鑒定。2原理玉米霜霉病主要由玉蜀黍霜指霉（Peronosclerosporamaydis）、高梁霜指霉（Psorghi）、菲律賓霜指霉(P.philippinensis)和甘蔗霜指霉（P．sacchari）引起，該類菌（以
3、下簡(jiǎn)稱玉米霜霉病菌Peronoscle-rosporaspp.）屬于卵菌綱(Oomycetes)，指梗霉目(Sclerosporales)，指梗霉科(Sclerosporaceae)，霜指霉屬(Peronosclerospora)。該病菌都是專性寄生在禾本科植物上(參見(jiàn)附錄A)，可侵染玉米的葉片和莖稈造成系統(tǒng)和局部癥狀。這4種病菌引起的玉米霜霉病有明顯的癥狀，病原菌有其獨(dú)特的形態(tài)特征，用特異引物對(duì)病菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)可獲得特異的DNA片段。病害的癥狀、病原菌的形態(tài)特性以及PCR特異反應(yīng)特征是鑒定玉米霜
4、霉病菌的主要依據(jù)。3試劑與材料棉藍(lán)乳酚油、吐溫-20、乙醇、11.5%NaOH、0.015%TrypaneBlue、乳酸、甘油、10倍PCR緩沖液、玉米霜霉病菌DNA的特異性引物、dNTP、Taq酶、5倍TBE電泳緩沖液、瓊脂糖凝膠(0.8%)、吸水紙、無(wú)菌水、蒸餾水，1000bpDNAladder等。4儀器及用具蓋玻片、載玻片、生物顯微鏡、高速臺(tái)式離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、天平、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR反應(yīng)管、微量移液器、移液器、解剖刀、培養(yǎng)皿、燒杯、漏斗、鑷子、分樣篩(5mm
5、、4mm、3mm)、吸管等。5現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)5.1產(chǎn)地檢測(cè)在寄主大田作物生長(zhǎng)期逐行進(jìn)行田間癥狀目測(cè)踏查。按要求采集有典型癥狀和疑似癥狀的玉米霜霉病樣本進(jìn)行室內(nèi)檢驗(yàn)鑒定。玉米霜霉病典型癥狀參見(jiàn)附錄B。5.2調(diào)運(yùn)檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)核實(shí)貨物有關(guān)單證,核實(shí)產(chǎn)地。重點(diǎn)檢查來(lái)自玉米霜霉病菌發(fā)生區(qū)的其寄主種子或原糧中是否夾帶玉米、高粱、甘蔗等葉片病殘?bào)w，是否夾帶穎殼的高粱種子；帶玉米、高梁植株殘?bào)w的包裝、鋪墊材料，以及甘蔗插條和其他玉米霜霉病菌寄主種苗葉片是否有可疑病斑，將檢獲物帶回實(shí)驗(yàn)室作進(jìn)一步檢驗(yàn)。6室內(nèi)檢測(cè)6.1寄主葉片等病殘?bào)w檢
6、測(cè)6.1.1直接鏡檢檢測(cè)如果寄主葉片上有白色霜霉?fàn)钗铮芍苯犹羧“咨够蛩喝в邪咨沟牟〗M織制成玻片樣品在顯微鏡下觀察病原菌的孢囊梗和孢子囊形態(tài)。如果染色觀察，加1滴棉藍(lán)乳酚油染色后立即用無(wú)1NY/T2050—2011菌水沖洗，然后用吸水紙吸干多余的染色液，加上蓋玻片在顯微鏡下鏡檢。對(duì)藏卵器和卵孢子的觀察需采集病葉褐色壞死部位。用鑷子取小片病組織,放在載玻片上，加一滴無(wú)菌水，用尖頭鑷子撥開(kāi)葉肉，放在顯微鏡下觀察葉肉中的藏卵器和卵孢子。病原菌形態(tài)特征參見(jiàn)附錄C。6.1.2保濕培養(yǎng)檢測(cè)如果可疑病葉未見(jiàn)有白
7、色霜霉?fàn)钗?可將病葉切段后分別放在培養(yǎng)皿中用吸水紙保濕,然后置于恒溫培養(yǎng)箱并在黑暗中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為21℃，相對(duì)濕度為100%，5h后每隔0.5h觀察1次，連續(xù)觀察6h，觀察孢囊梗及孢子囊的形成、孢子囊萌發(fā)長(zhǎng)出芽管的過(guò)程。觀察方法同6.1.1。對(duì)于田間有白色霜霉?fàn)钗锏募闹鞑∪~，需收集孢子囊置于18℃、100%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，1h～2h后觀察其萌發(fā)情況。6.2種子檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)病的玉米霜霉病病株的成熟種子內(nèi)部含有菌絲，種子穎殼、種皮表面可能帶有卵孢子，可采用以下方法確定種子是否被病菌感染。6.2.1
8、洗滌檢測(cè)從樣品中隨機(jī)取種子100粒,浸入25mL蒸餾水中（加入l滴吐溫），振蕩10min，取懸浮液，用離心機(jī)離心10min(2000g)，棄去上清液，沉淀物用2mL蒸餾水懸浮，鏡檢至少8滴～10滴懸浮液，觀察是否有卵孢子。病原菌形態(tài)特征參見(jiàn)附錄C。6.2.2透明染色檢測(cè)從樣品中隨機(jī)取種子400粒，在室溫下浸入11.5%NaOH和0.015%TrypaneBlue溶液中24h。浸泡后的種子在自來(lái)水中沖洗攪動(dòng),然后用
