漢坦病毒vero細(xì)胞滅活疫苗候選毒種篩選論文

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1、漢坦病毒Vero細(xì)胞滅活疫苗候選毒種篩選論文.freell和1∶320～1∶1280；4株毒株經(jīng)Vero細(xì)胞連續(xù)傳5代，培養(yǎng)液病毒滴度和抗原滴度分別達(dá)650～750LgCID50/ml和1∶160～1∶768；疫苗免疫家兔2針后.freell，15d左右收獲，無菌取腦，用含10%小牛血清基礎(chǔ)建立培養(yǎng)液(MEM)液制成鼠腦懸液，離心取上清，在Vero-E6細(xì)胞上測定病毒滴度以及利用反向被動血凝試驗(RPHA)測定病毒抗原。需要傳代的將腦懸液接種1～5d齡乳鼠，每只腦內(nèi)002ml。16病毒在Vero細(xì)胞上的適應(yīng)性傳代分別將漢灘病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7株和漢城病毒ZJ

2、5株鼠腦標(biāo)本研磨制成10%的鼠腦懸液，離心后取上清液接種Vero細(xì)胞，進(jìn)行適應(yīng)性傳代，培養(yǎng)7d左右，取細(xì)胞刮片進(jìn)行直接免疫熒光法(FA)〔5〕檢查細(xì)胞感染情況，待感染量達(dá)+++～++++，將細(xì)胞瓶凍入-30℃冰箱，過夜后融化離心，取上清傳代，連續(xù)傳5代，每代取細(xì)胞凍融液少許，用來測定病毒和抗原滴度。17病變(CPE)觀察將4株毒株感染長成單層的Vero細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，每隔3d用含3%小牛血清的MEM換液1次，并逐日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變發(fā)展情況，連續(xù)觀察12d。18敏感動物發(fā)病情況觀察候選的4株毒株在Vero細(xì)胞上適應(yīng)了5代后，將細(xì)胞凍融后離心的上清液(CP5)

3、腹腔注射2～5d齡的乳沙鼠，01ml/只，觀察乳鼠的發(fā)病情況并記錄發(fā)病或死亡時間。19FA法檢測病毒滴度(LgCCID50/ml)用025%胰酶消化生長良好的Vero-E6細(xì)胞，以適應(yīng)細(xì)胞濃度接種96孔微量培養(yǎng)板，每孔150μl，置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層，取待檢毒種液，做10倍系列稀釋，分別接種到E6單層細(xì)胞孔，接種量為10μl/孔，每個稀釋度接種4種，置37℃、5%CO2條件下吸附2h，然后加3%小牛血清MEM的細(xì)胞培養(yǎng)液150μl/孔，再置37℃孵箱培養(yǎng)6～7d，用FA檢查細(xì)胞感染病毒的情況，計算病毒滴度。110RPHA檢測病毒抗原量采用

4、96孔120°“V”型微量反應(yīng)板，每孔加25μlRPHA稀釋液，取25μl待檢毒種液于第一孔作1∶2，1∶4，1∶8……倍比稀釋，然后每孔加25μl致敏血球懸液，于微量震蕩器上混勻并置37℃水浴1～2h觀察結(jié)果。111Vero細(xì)胞滅活疫苗的研制選用ZJ2、ZJ4、ZJ7和ZJ5株作為疫苗株，將此毒株感染Vero單層細(xì)胞，培養(yǎng)后按生物制品規(guī)程中腎綜合征出血熱疫苗生產(chǎn)的方法研制疫苗〔6〕，最后以1∶4000β丙內(nèi)脂滅活。112免疫血清的制備和中和抗體效價的測定制成的疫苗經(jīng)安全試驗合格后(Vero-E6細(xì)胞盲傳3代陰性)，用于免疫家兔，每批4只，后腿肌肉注射10ml，7

5、d后以同法再免疫1次，第1次免疫后4周采血分離血清。每只家兔于免疫前4周采血，分離血清作為對照。應(yīng)用間接免疫熒光法(IFA)〔5〕和本實驗室建立的半微量直接免疫酶斑減少中和試驗(DPPRNT)〔7〕測定熒光抗體和中和抗體的效價。病毒用漢坦病毒國際標(biāo)準(zhǔn)株76-118和UR株。2結(jié)果21漢坦病毒在乳鼠腦內(nèi)傳代后病毒和抗原滴度的情況ZJ2、ZJ4、ZJ7和ZJ5毒株在乳沙鼠腦中連續(xù)傳了8，8，5，7代，其鼠腦冰凍切片經(jīng)直接免疫熒光檢查均呈強(qiáng)陽性，鼠腦懸液經(jīng)離心，上清液的病毒滴度和抗原滴度均較強(qiáng)。22各漢坦病毒在Vero細(xì)胞上的適應(yīng)性傳代4株毒株對Vero細(xì)胞均很敏感，但適應(yīng)

6、能力存在一定差異。ZJ4、ZJ7株接種Vero細(xì)胞第2代的免疫熒光強(qiáng)度即達(dá)到+++，而ZJ2、ZJ5株熒光相對較弱，經(jīng)5次傳代，4株毒株的免疫熒光強(qiáng)度和病毒滴度均有明顯的提高，免疫熒光強(qiáng)度均可以達(dá)到++++，ZJ2、ZJ4、ZJ7三株HTN型病毒呈片狀熒光，ZJ5株SEO型病毒呈顆粒狀熒光，結(jié)果傳5代后4株毒株的病毒滴度均達(dá)到650LgCCID50/ml，最高達(dá)750LgCCID50/ml，病毒抗原量均達(dá)到1∶160，最高達(dá)1∶768，隨著適應(yīng)代數(shù)的增加，病毒滴度和病毒抗原量呈遞增趨勢，遞增情況(表1)。23毒株對Vero細(xì)胞致病變的觀察連續(xù)觀察12d，4株毒株的1

7、～5代均不使Vero細(xì)胞產(chǎn)生病變。24毒株致乳沙鼠發(fā)病情況的觀察4株毒株的CP5攻擊乳鼠，7d后均發(fā)現(xiàn)乳鼠活動減少，精神萎靡，卷縮，后肢麻痹等癥狀發(fā)生，9d后出現(xiàn)死亡。表14株毒株經(jīng)Vero細(xì)胞傳代后不同代次的病毒滴度和抗原滴度（略）25家兔免疫疫苗后中和抗體的應(yīng)答情況用ZJ4株和ZJ5株制備的2批單價原液滅活疫苗免疫家兔，2針后的免疫血清經(jīng)DPPRNT測定，對同型毒株的中和抗體效價，3/4只家兔不低于1∶10。3討論本結(jié)果顯示，經(jīng)5代傳代后，病毒在Vero細(xì)胞上已較好適應(yīng)，病毒滴度和抗原量均有明顯提高。病毒滴度均穩(wěn)定在6