金黃色葡萄球菌生物膜對茶樹油的抵抗性研究論文

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1、金黃色葡萄球菌生物膜對茶樹油的抵抗性研究論文黃曉敏王婧婷陳春營李海妙林良佳余曉鈴曾穗紅【摘要】目的研究金黃色葡萄球菌生物膜對茶樹精油的抵抗力。方法采用Broin完全被殺滅；培養(yǎng)7d的金黃色葡萄球菌生物膜對體積分數(shù)0.75％茶樹油耐受時間最長，作用120min才被完全清除，用金黃色葡萄球菌浮游菌滴染濾膜經(jīng)體積分數(shù)2.0％茶樹油處理后，均在10min內(nèi)被完全殺滅。結(jié)論形成生物膜的細菌對茶樹油的抵抗力比浮游菌強，隨著生物膜形成時間延長，抵抗力明顯增加。【關(guān)鍵詞】茶樹油金黃色葡萄球菌生物膜抵抗力茶樹油（TeaTreeoli）是桃金娘科（Myrtaceae）

2、白千層屬（Melaleuca）灌木樹種-互葉白千層（Melaleucaalternifolia）的新鮮枝葉經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的芳香精油。近年來.freel，BF）是多種病原微生物常見的污染方式，如銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌等，這些能形成生物膜的致病菌和條件致病菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌，也是醫(yī)用材料發(fā)生細菌污染的重要原因。為研究金黃色葡萄球菌生物膜對茶樹精油的抵抗力，采用Brol，將吐溫80緩慢滴入茶樹油中并振蕩使其乳化成乳化液，經(jīng)0.22μm孔徑濾膜濾過除菌4℃冰箱保存。1.3試劑和儀器TDR-200B全自動型微生物

3、分析儀（長沙天地人生物科技有限公司），721分光光度計（上海第三分析儀器廠），Olympus光學(xué)顯微鏡，日立CO2臨界點干燥儀，日立HCP-2離子濺射儀，日立E-1010掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。1.4生物膜制備采用Bro測定其吸光度值，使菌懸液的A值達0.029（相當(dāng)細菌數(shù)約為1.5×106CFU/ml）。將此菌懸液用LB肉湯稀釋10倍，注入1.5×15cm無菌試管內(nèi)5ml，同時加入已滅菌的制備成1.0cm×1.0cm的一次性輸液管片（已壓平），37℃培養(yǎng)，隔2d換1次LB肉湯連續(xù)培養(yǎng)7d，即可形成成熟的金黃色葡萄球菌生物膜。1.5中和劑選

4、擇實驗以金黃色葡萄球菌作為指標菌，按中華人民共和國衛(wèi)生部2002版的《消毒技術(shù)規(guī)范》執(zhí)行，設(shè)平行6組（分組情況見表1）進行載體定量鑒定試驗。結(jié)果第6組不長菌，第1組不長菌或長菌少于第2組，第2組長菌數(shù)≥100CFU/ml，第3，4，5組組間菌數(shù)在1.0×105～1.0×106CFU/ml之間，組間菌量誤差率≤15％，表明所選中和劑及濃度適宜。實驗重復(fù)3次。1.6生物膜形成的顯微鑒定從菌懸液中取出已培養(yǎng)3d和7d的BF的載體，經(jīng)無菌生理鹽水沖洗去除浮游細菌，單染色，光學(xué)顯微鏡油鏡觀察可見排列緊密的葡萄球菌細菌層，棄去。取同時培養(yǎng)的其他BF載體膜，用p

5、H7.2的0.1mol/LPBS（4℃預(yù)冷）漂洗，在4℃環(huán)境中，以2.5%的戊二醛（為本實驗室配制）固定4h；用PBS漂洗3次，15min/次；按50%，70%，90%，100%體積分數(shù)系數(shù)的乙醇梯度脫水，每梯度15min，其中100%乙醇脫水3次；用醋酸異戊酯置換乙醇0.5h；CO2臨界點干燥；黏臺，噴金，掃描電鏡（SEM）觀察確認（所用試劑均為南方醫(yī)科大學(xué)電鏡室配制）。1.7生物膜對茶樹油抵抗力測定分別將一定量的茶樹油乳液加入到LB培養(yǎng)液內(nèi)，使茶樹油在培養(yǎng)液內(nèi)的終濃度分別為體積分數(shù)2.0％，1.5％和0.75％，調(diào)pH值至7.4，分別取各5ml

6、置無菌三角燒瓶內(nèi)，并取培養(yǎng)3d和7d的生物膜載體膜片，用無菌生理鹽水沖洗去除浮游細菌，每5ml體積分數(shù)值的無菌三角燒瓶內(nèi)放入一張膜片，22℃水?。ú缓魏嗡幬锱囵B(yǎng)基作為陽性對照），作用不同時間，取出生物膜載體，加入裝有5ml中和劑的玻璃勻漿器內(nèi)，中和作用10min，將膜片得到完全研磨，使載體表面的BF及BF內(nèi)的細菌脫落，形成菌懸液，再用連續(xù)稀釋法進行活菌計數(shù)，每個時間段測試3次。同時以金黃色葡萄球菌浮游菌（細菌數(shù)約為1.5×106CFU/ml）菌懸液進行載體定量殺菌實驗，作為比較。2結(jié)果2.1中和劑實驗結(jié)果結(jié)果表明，含卵磷脂1g/L、硫代硫酸鈉1，

7、10g/L吐溫80的PBS作為中和劑，可有效中和茶樹油對試驗菌的殘留作用，符合所定中和劑要求。見表1。表1茶樹油中和劑實驗結(jié)果（略）2.2掃描電鏡鑒定BF的形成見圖1～2。從圖1可見培養(yǎng)3d的金黃色葡萄球菌生物被膜細菌呈球狀，隱約可見細菌之間的黏液絲借助其使部分細菌相互連接，而大部分細菌仍呈分散狀為不成熟生物膜。從圖2可見培養(yǎng)7d的金黃色葡萄球菌生物被膜細菌數(shù)量增多，細菌之間的黏液絲將細菌相互連接形成生物膜。由于在載體樣品處理過程中經(jīng)脫水、干燥等步驟，因此可以推測生物膜中細菌之間在未經(jīng)處理前充滿了黏液。圖1載體在S.aureus懸液中培養(yǎng)3d（不成

8、熟BF）（掃描電鏡,3000×）（略）圖2載體在S.aureus懸液中培養(yǎng)7d（成熟BF）（掃描電鏡,5000×)（略）2