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《重組梅毒螺旋體多表位抗原的改進(jìn)及應(yīng)用論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、重組梅毒螺旋體多表位抗原的改進(jìn)及應(yīng)用論文【摘要】目的對(duì)梅毒螺旋體抗原表位進(jìn)一步優(yōu)化，以滿足梅毒檢測(cè)試劑的需要。方法用信息生物學(xué)軟件對(duì)梅毒螺旋體TpN47抗原表位進(jìn)行分析，在我們以前研究工作的基礎(chǔ)上，延伸其長(zhǎng)度，用化學(xué)合成法獲得目的基因，插入到pBVIL1載體中，構(gòu)建pBVIL1/TpN47表達(dá)質(zhì)粒。將新獲得的TpN47基因與本研究室保存的TpN15、TpN17、TpN44.5基因片段相連接，進(jìn)行嵌合表達(dá).freelprovementbasedonrebinantmulti-epitopechimericantigenTreponemapallidumanditsapplicationSONG
2、Xiao-gou，edicalSciences,AMMS,Beijing100850,China【Abstract】ObjectiveInordertodetectKitantibodiesofsyphilis，theepitopechimericantigenofTreponemapallidumizedfurther.MethodsTreponemapallidumTpN47antigenepitopeationbiologysoftent.TherebinantTreponemapallidummulti-epitopechimericantigensulti-epitopechime
3、ricantigense-linkedimmunosorbentassay(ELISA).ResultsImprovementbasedonrebinantmulti-epitopechimericantigenTreponemapallidumantigensulti-epitopechimericantigenofTreponemapallidumemntforneapallidum；multi-epitopechimericantigen;TpN47；panel目前，臨床上對(duì)梅毒螺旋體感染的檢測(cè)，常用的方法是血清學(xué)檢測(cè)，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）［1］法等，此方法所用抗原絕大部分
4、為重組蛋白。在以前的研究［2］中，我們分別選擇了TpN15、TpN17、TpN44.5和TpN47的優(yōu)勢(shì)抗原表位，進(jìn)行了克隆和表達(dá)，并將此四組基因連接，在E.coli中進(jìn)行了嵌合表達(dá)，此抗原在當(dāng)時(shí)梅毒感染血清學(xué)檢測(cè)中起了重要作用，但隨著新一代參考品（panel）的起用，我們發(fā)現(xiàn)不能完全滿足檢測(cè)試劑的需要，其原因可能是TpN47基因片段過(guò)短所致，因當(dāng)時(shí)為了最大限度縮短基因長(zhǎng)度，以降低非特異性反應(yīng)，僅選用了24個(gè)氨基(78～101)。我們?cè)俅我悦范救蚪M序列［3］為基礎(chǔ)，用Biosun分子生物學(xué)軟件［4］重新對(duì)抗原表位進(jìn)行了全面系統(tǒng)地分析，增加TpN47基因長(zhǎng)度，即選用400個(gè)氨基酸（1～40
5、0），這樣可能會(huì)提高抗原的覆蓋面。此片段經(jīng)與TpN15、TpN17、TpN44.5基因片段相連接，進(jìn)行嵌合克隆表達(dá)純化后采用雙抗原夾心法對(duì)梅毒參考品進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果符合要求。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株及質(zhì)粒原核融合表達(dá)載體pBVIL1、pBVIL1/TpN15、pBVIL1/TpN17、pBVIL1/TpN44.5表達(dá)質(zhì)粒由本室構(gòu)建并保存；E.coliHB101，由本室保存。1.1.2工具酶和試劑DNA限制內(nèi)切酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、Promega公司生產(chǎn)的T4DNA連接酶及T4DNA聚合酶購(gòu)自博大泰克生物技術(shù)公司；氨芐西林用于配制LB培養(yǎng)基的胰化蛋白胨（bacto-trypto
6、ne）及酵母提取物(bacto-yeast)購(gòu)自本院條件處。1.1.3引物、序列測(cè)定由奧科生物技術(shù)有限公司合成，三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。1.1.4梅毒參考品（panel）中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。1.2方法1.2.1TpN47抗原表位的選擇先從網(wǎng)上Gene-Bank中獲得TpN47蛋白的氨基酸全序列，用Biosun分子生物學(xué)軟件對(duì)其抗原表位進(jìn)行分析，選取抗原性較強(qiáng)部分。1.2.2TpN47基因的合成方法根據(jù)所選擇的TpN47抗原表位的氨基酸序列，按大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)密碼子，推斷出編碼抗原表位的基因序列。設(shè)計(jì)多條有部分重疊序列的基因片段，從中間向兩端逐步延伸合成。設(shè)計(jì)時(shí)，如發(fā)現(xiàn)基因中有與Xho1、Xb
7、aI1及Spe1相同的酶切位點(diǎn),要作適當(dāng)調(diào)整。1.2.3PCR擴(kuò)增、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)等參照［美］Sambroob,J.等箸，黃培堂等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指南》第三版有關(guān)章節(jié)進(jìn)行。具體擴(kuò)增條件為95℃1min,55℃1min，72℃1.30min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后，再72℃延伸7min。1.2.4純化從表達(dá)菌中提取包涵體,.freelMTE、1%β－巰基乙醇,8M脲pH8.5)將其溶解,然后以SP-S
