重組梅毒螺旋體多表位抗原的改進(jìn)及應(yīng)用

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1、重組梅毒螺旋體多表位抗原的改進(jìn)及應(yīng)用【摘要】目的對(duì)梅毒螺旋體抗原表位進(jìn)一步優(yōu)化，以滿足梅毒檢測(cè)試劑的需要。方法用信息生物學(xué)軟件對(duì)梅毒螺旋體TpN47抗原表位進(jìn)行分析，在我們以前研究工作的基礎(chǔ)上，延伸其長(zhǎng)度，用化學(xué)合成法獲得目的基因，插入到pBVIL1載體中，構(gòu)建pBVIL1/TpN47表達(dá)質(zhì)粒。將新獲得的TpN47基因與本研究室保存的TpN15、TpN17、TpN44.5基因片段相連接，進(jìn)行嵌合表達(dá)，經(jīng)純化后用雙抗原夾心法測(cè)其活性。結(jié)果經(jīng)改進(jìn)的重組梅毒螺旋體多表位嵌合抗原，用于檢測(cè)國(guó)家新一代的參考品

2、，其陽(yáng)性及陰性符合率均為100%，4份靈敏度符合參考品的要求。結(jié)論所構(gòu)建的pBVIL1/TpN15＋TpN44.5＋TpN17＋TpN47嵌合質(zhì)粒，在E.coli中獲得了高效表達(dá)，經(jīng)測(cè)定，此抗原可滿足新一代梅毒檢測(cè)試劑的需要?！娟P(guān)鍵詞】梅毒螺旋體；TpN47；嵌合抗原；參考品Improvementbasedonrebinantmulti-epitopechimericantigenTreponemapallidumanditsapplicationSONGXiao-gou，edicalScience

3、s,AMMS,BEijing100850,China【Abstract】ObjectiveInordertodetectKitantibodiesofsyphilis，theepitopechimericantigenofTreponemapallidumizedfurther.MethodsTreponemapallidumTpN47antigenepitopeationbiologysoftent.TherebinantTreponemapallidummulti-epitopechimeric

4、antigensulti-epitopechimericantigense-linkedimmunosorbentassay(ELISA).ResultsImprovementbasedonrebinantmulti-epitopechimericantigenTreponemapallidumantigensulti-epitopechimericantigenofTreponemapallidumemntforneapallidum；multi-epitopechimericantigen;Tp

5、N47；panel目前，臨床上對(duì)梅毒螺旋體感染的檢測(cè)，常用的方法是血清學(xué)檢測(cè)，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）［1］法等，此方法所用抗原絕大部分為重組蛋白。在以前的研究［2］中，我們分別選擇了TpN15、TpN17、TpN44.5和TpN47的優(yōu)勢(shì)抗原表位，進(jìn)行了克隆和表達(dá)，并將此四組基因連接，在E.coli中進(jìn)行了嵌合表達(dá)，此抗原在當(dāng)時(shí)梅毒感染血清學(xué)檢測(cè)中起了重要作用，但隨著新一代參考品（panel）的起用，我們發(fā)現(xiàn)不能完全滿足檢測(cè)試劑的需要，其原因可能是TpN47基因片段過(guò)短所致，因當(dāng)時(shí)為了最大

6、限度縮短基因長(zhǎng)度，以降低非特異性反應(yīng)，僅選用了24個(gè)氨基(78～101)。我們?cè)俅我悦范救蚪M序列［3］為基礎(chǔ)，用Biosun分子生物學(xué)軟件［4］重新對(duì)抗原表位進(jìn)行了全面系統(tǒng)地分析，增加TpN47基因長(zhǎng)度，即選用400個(gè)氨基酸（1～400），這樣可能會(huì)提高抗原的覆蓋面。此片段經(jīng)與TpN15、TpN17、TpN44.5基因片段相連接，進(jìn)行嵌合克隆表達(dá)純化后采用雙抗原夾心法對(duì)梅毒參考品進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果符合要求。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株及質(zhì)粒原核融合表達(dá)載體pBVIL1、pBVIL1/TpN

7、15、pBVIL1/TpN17、pBVIL1/TpN44.5表達(dá)質(zhì)粒由本室構(gòu)建并保存；E.coliHB101，由本室保存。1.1.2工具酶和試劑DNA限制內(nèi)切酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、Promega公司生產(chǎn)的T4DNA連接酶及T4DNA聚合酶購(gòu)自博大泰克生物技術(shù)公司；氨芐西林用于配制LB培養(yǎng)基的胰化蛋白胨（bacto-tryptone）及酵母提取物(bacto-yeast)購(gòu)自本院條件處。1.1.3引物、序列測(cè)定由奧科生物技術(shù)有限公司合成，三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序。1.1.4梅毒參考品（panel）中國(guó)藥品

8、生物制品檢定所提供。1.2方法1.2.1TpN47抗原表位的選擇先從網(wǎng)上Gene-Bank中獲得TpN47蛋白的氨基酸全序列，用Biosun分子生物學(xué)軟件對(duì)其抗原表位進(jìn)行分析，選取抗原性較強(qiáng)部分。1.2.2TpN47基因的合成方法根據(jù)所選擇的TpN47抗原表位的氨基酸序列，按大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)密碼子，推斷出編碼抗原表位的基因序列。設(shè)計(jì)多條有部分重疊序列的基因片段，從中間向兩端逐步延伸合成。設(shè)計(jì)時(shí)，如發(fā)現(xiàn)基因中有與Xho1、XbaI1及Spe1相同的酶切位點(diǎn),要作適當(dāng)調(diào)整。