人notch1shrna慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

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1、人notch1shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定張燕,張明芳,林玲,鄭志竑【摘要】　　目的構(gòu)建人notch1shRNA慢病毒表達(dá)載體，為Notch信號(hào)通路的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。方法根據(jù)人notch1基因mRNA序列設(shè)計(jì)并合成兩條互補(bǔ)的DNA單鏈寡核苷酸，將退火后形成的雙鏈連接于pENTR/U6質(zhì)粒，通過(guò)與pLenti6/BLOCKiTDEST載體的LR重組，構(gòu)建notch1shRNA慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)入293FT細(xì)胞，包裝成慢病毒。用該慢病毒感染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤系SHSY5Y細(xì)胞，RTPCR和慢病毒RNAi表達(dá)系統(tǒng)、293

2、FT細(xì)胞、大腸桿菌Top10、Stbl3化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌、脂質(zhì)體Lipofectamine2000(美國(guó)Invitrogen公司);質(zhì)粒抽提純化試劑盒(荷蘭QIAGEN公司，德國(guó)TIANGEN公司);TaqDNA聚合酶(美國(guó)Promega公司);DL2000DNAmarker(日本Takara公司);DMEM、PRMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);兔抗人Notch1抗體(美國(guó)Chemicon公司);小鼠抗人GAPDH抗體(美國(guó)SantaCruz公司);辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗兔IgG、HRP兔抗小鼠IgG抗體和ECL化學(xué)發(fā)光

3、試劑盒(美國(guó)CellSignaling公司)。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤系SHSY5Y購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞寡核苷酸片段由南京金思科公司合成，PCR引物由上海Invitrogen英駿生物技術(shù)公司合成。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?！　?.2方法　　1.2.1編碼目的shRNA的單鏈DNA寡核苷酸片斷的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)GenBank中notch1基因mRNA序列(NM017617)，找出兩條符合要求的靶序列：　　7745’CGACGATTGTCCAGGAAACAA3’794　　22415’GACCAACTGTGACATCAACAA3’22

4、61　　參照BLOCKiTTM慢病毒RNAi表達(dá)系統(tǒng)的要求，設(shè)計(jì)和合成兩對(duì)針對(duì)靶序列和一對(duì)陰性對(duì)照的可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的正義鏈和反義鏈：　　notch1shRNA774:　　top鏈：5’caccGTTGTTTCCTGGACAATCGTCGcga　　aCGACGATTGTCCAGGAAACAA3’　　bottom鏈：5’aaaaTTGTTTCCTGGACAATCGTCGtt　　cgCGACGATTGTCCAGGAAACAAC3’　　notch1shRNA2241:　　top鏈：5’caccGTTGTTGATGTCACAGTTGG

5、TCcg　　aaGACCAACTGTGACATCAACAA3’　　bottom鏈：5’aaaaTTGTTGATGTCACAGTTGGTC　　ttcgGACCAACTGTGACATCAACAAC3’　　陰性對(duì)照shRNA:　　top鏈：5’caccGTTCTCCGAACGTGTCACGTcgaaA　　CGTGACACGTTCGGAGAA3’　　bottom鏈：5’aaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTttcg　　ACGTGACACGTTCGGAGAAC3’　　1.2.2重組pENTR/U6入門載體的構(gòu)建合成的單鏈寡核苷酸序列

6、經(jīng)退火后，與線性化的載體pENTR/U6行連接反應(yīng)。常規(guī)方法轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)菌，在含卡那霉素的LB平板篩選重組克隆。PCR方法進(jìn)行鑒定，引物為pENTR/U6的U6和M13測(cè)序引物，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min后進(jìn)入循環(huán)，94℃30s→58℃30s→72℃30s，共25個(gè)循環(huán)，72℃終延伸7min。擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為289bp，并由南京金思特公司進(jìn)行序列測(cè)定。根據(jù)鑒定結(jié)果選出3個(gè)序列正確的菌株[分別含質(zhì)粒pEntryNDA(shRNA774～794)、pEntryNDB(shRNA2241～2261)、pEntryNDContr

7、(陰性對(duì)照shRNA)]進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?！　?.2.3重組慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定取重組的入門載體與慢病毒骨架載體pLenti6/BLOCKiTDEST行LR重組反應(yīng)。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)細(xì)菌，含氨芐青霉素的LB平板篩選重組克隆。用U6和V5引物行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5min后進(jìn)入循環(huán)，94℃30s→55℃30s→72℃60s，共25個(gè)循環(huán)，72℃終延伸7min。擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為237bp。取PCR鑒定陽(yáng)性的重組菌涂布于含氨芐青霉素或氯霉素的LB平板，觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)。將重組了pEntryNDA、pEntryNDB、pE

8、ntryNDContr的shRNA表達(dá)盒的慢病毒載體相應(yīng)稱為L(zhǎng)RNDA、LRNDB、LRNDContr?！　?.2.4慢病毒的包裝和滴