人notch1shrna慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

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1、人notch1shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定作者：張燕,張明芳,林玲,鄭志竑【摘要】　　目的構(gòu)建人notch1shRNA慢病毒表達(dá)載體，為Notch信號通路的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。方法根據(jù)人notch1基因mRNA序列設(shè)計并合成兩條互補的DNA單鏈寡核苷酸，將退火后形成的雙鏈連接于pENTR/U6質(zhì)粒，通過與pLenti6/BLOCKiTDEST載體的LR重組，構(gòu)建notch1shRNA慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)入293FT細(xì)胞，包裝成慢病毒。用該慢病毒感染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤系SHSY5Y細(xì)胞，RTPCR和Westernblot法檢測細(xì)胞notch1基因的表

2、達(dá)。結(jié)果目的序列成功連接于載體并包裝成較高滴度的慢病毒，細(xì)胞mRNA和蛋白質(zhì)的檢測均表明構(gòu)建的notch1shRNA慢病毒表達(dá)載體LRNDA能顯著抑制SHSY5Y細(xì)胞notch1基因的表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建人notch1shRNA慢病毒表達(dá)載體。【關(guān)鍵詞】RNA基因表達(dá)慢病毒屬遺傳載體信號傳導(dǎo)　　Notch信號通路與動物和人體的胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化以及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，Notch受體是一類由2753個氨基酸組成的跨膜受體，其同源分子包括Notchl～4。Notch通過與配體DSL(DeltaSerrateLag152)家族蛋白結(jié)合激活后，可開關(guān)細(xì)胞周期的

3、轉(zhuǎn)換、調(diào)控細(xì)胞凋亡、生存命運的選擇以及分化等，作為Notch信號通路的重要成分Notch1受體也就成為人們研究的重要靶點[12]。RNA干擾(RNAi)技術(shù)可高效、特異地下調(diào)靶基因的表達(dá)，是一種簡便而快速的基因功能研究的手段[3]。慢病毒表達(dá)載體可有效地轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，并能夠整合于宿主細(xì)胞的基因組而較長期穩(wěn)定地表達(dá)導(dǎo)入目的基因或片段，是理想的RNAi研究的表達(dá)載體。為了更好地進行Notch1信號通路與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤關(guān)系和基因治療的研究，本實驗利用能夠表達(dá)小干擾RNA的慢病毒載體，構(gòu)建靶向notch1基因的表達(dá)小發(fā)卡RNA(shRNA)的慢病毒表達(dá)載體，為建立notch1

4、基因表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞模型及其相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)?！　?材料與方法　　1.1材料BLOCKiTTM慢病毒RNAi表達(dá)系統(tǒng)、293FT細(xì)胞、大腸桿菌Top10、Stbl3化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌、脂質(zhì)體Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司);質(zhì)粒抽提純化試劑盒(荷蘭QIAGEN公司，德國TIANGEN公司);TaqDNA聚合酶(美國Promega公司);DL2000DNAmarker(日本Takara公司);DMEM、PRMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);兔抗人Notch1抗體(美國Chemicon公司);小鼠抗人GAPDH抗體(美國SantaCruz

5、公司);辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗兔IgG、HRP兔抗小鼠IgG抗體和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國CellSignaling公司)。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤系SH15SY5Y購自中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞寡核苷酸片段由南京金思科公司合成，PCR引物由上海Invitrogen英駿生物技術(shù)公司合成。其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。　　1.2方法　　1.2.1編碼目的shRNA的單鏈DNA寡核苷酸片斷的設(shè)計和合成根據(jù)GenBank中notch1基因mRNA序列(NM017617)，找出兩條符合要求的靶序列：　　7745’CGACGATTGTCCAGGAAACAA3’794　

6、　22415’GACCAACTGTGACATCAACAA3’2261　　參照BLOCKiTTM慢病毒RNAi表達(dá)系統(tǒng)的要求，設(shè)計和合成兩對針對靶序列和一對陰性對照的可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的正義鏈和反義鏈：　　notch1shRNA774:　　top鏈：5’caccGTTGTTTCCTGGACAATCGTCGcga　　aCGACGATTGTCCAGGAAACAA3’15　　bottom鏈：5’aaaaTTGTTTCCTGGACAATCGTCGtt　　cgCGACGATTGTCCAGGAAACAAC3’　　notch1shRNA2241:　　top鏈：5’

7、caccGTTGTTGATGTCACAGTTGGTCcg　　aaGACCAACTGTGACATCAACAA3’　　bottom鏈：5’aaaaTTGTTGATGTCACAGTTGGTC　　ttcgGACCAACTGTGACATCAACAAC3’　　陰性對照shRNA:　　top鏈：5’caccGTTCTCCGAACGTGTCACGTcgaaA　　CGTGACACGTTCGGAGAA3’　　bottom鏈：5’aaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTttcg15　　ACGTGACACGTTCGGAGAAC3’