窄譜中波紫外線對角質(zhì)形成細(xì)胞肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子mrna的影響

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1、窄譜中波紫外線對角質(zhì)形成細(xì)胞肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子mRNA的影響：羅素菊，彭振輝，鄭焱，張路坤，王國榮，徐浩翔【摘要】目的研究窄譜中波紫外線(NBUVB)對培養(yǎng)的正常人角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)增殖和肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子(HBEGF)mRNA表達(dá)的影響。方法用50mJ/cm2和100mJ/cm2NBUVB照射正常人KC后繼續(xù)培養(yǎng)12h，用MTT法和實(shí)時熒光定量RTPCR法分別檢測KC增殖和HBEGFmRNA的改變。結(jié)果NBUVB照射正常人KC后,可劑量依賴抑制KC的增殖和上調(diào)HBEGFmRNA的表達(dá)。50mJ/cm2和100mJ/cm2NBUVB照

2、射后，分別使KC增殖抑制5.4%和8.7%，使HBEGFmRNA增加到正常對照組的1.7倍和2.5倍。結(jié)論NBUVB抑制KC的增殖部分是通過上調(diào)HBEGF的表達(dá)介導(dǎo)的?！娟P(guān)鍵詞】表皮生長因子；角質(zhì)形成細(xì)胞；窄譜中波紫外線在亞熱帶中銀屑病少見，并且銀屑病有冬重夏輕的特點(diǎn)。這種現(xiàn)象提示溫度和日光可能與銀屑病的發(fā)病有關(guān)。自20世紀(jì)70年代，臨床開始應(yīng)用補(bǔ)骨脂素長波紫外線(psoralensplusultravioletA,PUVA)治療銀屑病、白癜風(fēng)等皮膚科疾病，之后用中波紫外線(ultravioletB,UVB)代替UVA。研究發(fā)現(xiàn)310nm左右的紫外線對銀屑病的治療效果

3、最佳，紅斑效應(yīng)相對較小。因此，濾除其他波長紫外線所產(chǎn)生的波長在311nm左右的窄譜中波紫外線(narroalgroinggroRNA表達(dá)的影響?！　?材料與方法　　1.1主要儀器和試劑　　KC無血清培養(yǎng)基(KCSFM)、低糖DMEM、Dispase酶均購于Gibco公司，依曲替酸(重慶華邦公司)，TRIzol試劑(Invitrogen公司)，RTPCR試劑盒(MBI公司)，SYBRgreen2×PCRmastermix(ABI公司)，PCR配套試劑(TaKaRa公司)，NBUVB光源(7900sequencedetector(ABI公司)?！　?.2原代KC的培養(yǎng)　　

4、取健康人環(huán)切術(shù)后包皮，消毒液浸泡后，置于2.5g/LDispase酶4℃消化過夜，次日分離表、真皮，將表皮置于2.5g/L胰酶與0.02g/LEDTA(1∶1)混合液中，消化10min，用含100mL/L胎牛血清的DMEM終止消化，吹打后，100目篩網(wǎng)過濾，離心收集細(xì)胞，加入KCSFM，吹打后接種入培養(yǎng)瓶，于37℃、50mL/LCO2條件下培養(yǎng)，次日更換新培養(yǎng)基，以后每3d換液一次，當(dāng)細(xì)胞70%-80%融合時傳代，取3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[5]。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞傳代入6孔板中，當(dāng)細(xì)胞90%融合時，用PBS沖洗后，覆蓋薄層PBS，然后用50mJ/cm2和100mJ/cm2NBUVB

5、垂直照射KC，照射后換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12h，每組設(shè)3個孔，并設(shè)置未照射的正常對照組?！　?.3MTT　　將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，用50mJ/cm2和100mJ/cm2NBUVB垂直照射，繼續(xù)培養(yǎng)12h。設(shè)正常對照組和空白對照組(只加細(xì)胞培養(yǎng)液無細(xì)胞)。吸出培養(yǎng)液，每孔中加入MTT(5g/L)后再孵育4h，棄上清液后每孔加入二甲基亞砜150μL，振蕩10min。以空白對照組為基準(zhǔn)，在490nm波長處檢測吸光度值。生長抑制率(%)=1-A490nm(實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞)/A490nm(對照組細(xì)胞)×100%?！　?.4總RNA的提取　　按1mL/10cm2(培養(yǎng)瓶

6、面積)加入TRIzol提取總RNA，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。用12g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性，用紫外分光光度計測定RNA含量和純度?！　?.5cDNA的合成　　在反應(yīng)管中加入2μg總RNA、1μLoLigo(dT)18和1mL/LDEPC處理水至12μL，70℃5min，加入5×緩沖液4μL，RNA酶抑制劑20u，10mmoL/LdNTP2μL，37℃5min后，加入MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶200u，42℃60min，70℃10min，冰上冷卻，-20℃保存?zhèn)溆??！　?.6實(shí)時熒光定量PCR的檢測　　用10倍比例稀釋βactin基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做相對定量的標(biāo)準(zhǔn)

7、品。βactin基因PCR反應(yīng)體系為12.5μL，包括：10×PCRbuffer1.25μL，dNTP0.8μL，上游和下游引物各0.8μL，rTaq0.08μL，cDNA2μL，加水至12.5μL。反應(yīng)條件：94℃5min，然后94℃30s，55℃30s，72℃1min，循環(huán)40次，最后72℃10min，4℃保存?zhèn)溆?。?shí)時定量PCR反應(yīng)體系為25μL，包括：模板cDNA2μL，ABISYBRGreen2×PCRmastermix12.5μL，H2O1μL，上游和下游引物(βactin或HBEG