依曲替酸對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子mrna的影響論文

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1、依曲替酸對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子mRNA的影響論文羅素菊，彭振輝，鄭焱，張路坤，王蔚，王國(guó)榮【摘要】目的研究依曲替酸對(duì)培養(yǎng)的正常人角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)增殖和肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子(HBEGF)mRNA表達(dá)的影響。方法0.1和1μmol/L伊曲替酸處理正常人KC12h后，用噻唑藍(lán)比色法(MTT法)和實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)法分別檢測(cè)KC增殖和HBEGFmRNA表達(dá)的改變。結(jié)果依曲替酸處理12h后，可劑量依賴抑制KC的增殖和上調(diào)HBEGFmRNA的表達(dá)。0.1和1μmol

2、/L伊曲替酸分別使KC增殖抑制10.2%和14.4%.freelRNA增加到正常對(duì)照組的3.2和7.1倍。與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論依曲替酸可劑量依賴上調(diào)HBEGFmRNA的表達(dá)，其可能參與依曲替酸對(duì)KC增殖的抑制作用?！娟P(guān)鍵詞】表皮生長(zhǎng)因子；角質(zhì)形成細(xì)胞；維甲酸EffectofacitretinininducingtheexpressionofheparinbindingepidermalgroRNAinnormalhumankeratinocytesABSTRACT:ObjectiveT

3、oinvestigatethealterationofcellproliferationandheparinbindingepidermalgroRNAexpressioninculturednormalhumankeratinocytesafteracitretintreatment.MethodsAftera12hourincubationol/Lacitretininnormalhumankeratinocytes,theproliferationpotencyofthecellsetricassayandth

4、eexpressionofHBEGFmRNAinedbyrealtimequantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR).ResultsBothkeratinocytesgroRNAexpressionentol/Lacitretininhibitedkeratinocyteproliferationby10.2%and14.4%,andelevatedHBEGFmRNAby3.2and7.1fold,respectively.Conc

5、lusionUpregulatedHBEGFmRNAexpressioninducedbyacitretininnormalhumankeratinocytesmaybeinvolvedinregulatingkeratinocytegroent.KEY)、低糖DMEM、Dispase酶均購(gòu)于Gibco公司，依曲替酸為重慶華邦制藥股份有限公司惠贈(zèng)，TRIzol試劑購(gòu)于Invitrogen公司，RTPCR試劑盒購(gòu)于Fermentas公司，SYBRgreen2×PCR混合液購(gòu)于ABI公司，PCR配套試劑購(gòu)于TaKaRa公司

6、，GeneAmp9700PCR儀和PRISM7900PCR儀均為ABI公司產(chǎn)品。1.2原代KC的培養(yǎng)取健康人環(huán)切術(shù)后包皮，消毒液浸泡后，置于2.5g/LDispase酶4℃消化過(guò)夜。次日分離表、真皮，將表皮置于2.5g/L胰酶與0.2g/LEDTA(1∶1)混合液中，消化10min，用含100mL/L胎牛血清的DMEM終止消化，吹打后，100目篩網(wǎng)過(guò)濾，離心收集細(xì)胞，加入KCSFM，接種入培養(yǎng)瓶，于37℃、50mL/LCO2條件下培養(yǎng)，次日更換新培養(yǎng)基，以后每3d換液一次，取3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)5。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞傳代入6孔培

7、養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞90%融合時(shí)，進(jìn)行干預(yù)處理，繼續(xù)培養(yǎng)12h。每組設(shè)3個(gè)孔，并設(shè)置未處理的正常對(duì)照組。1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，加入含0.1或1μmol/L依曲替酸的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12h。設(shè)空白對(duì)照組(只加細(xì)胞培養(yǎng)液，無(wú)細(xì)胞)。吸出培養(yǎng)液，每孔中加入MTT(5mg/mL)后再孵育4h，棄上清液后每孔加入二甲基亞砜150μL，振蕩10min。以空白對(duì)照組為基準(zhǔn)，在490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。生長(zhǎng)抑制率(%)=1-A490nm(實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞)/A490nm(對(duì)照組細(xì)胞)×100%。1.

8、4總RNA的提取和cDNA的合成按10cm2(培養(yǎng)瓶面積)加入1mLTRIzoL提取總RNA，操作嚴(yán)按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。用12g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性，用紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA含量和純度。cDNA的合成操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。1.5實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR檢測(cè)HBEGFmRNA的表達(dá)用1