220例無精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者遺傳學(xué)研究

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1、220例無精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者遺傳學(xué)研究【摘要】目的:檢查無精子、嚴(yán)重少精子患者的染色體異常和Y染色體上無精子基因(AZF)微缺失的遺傳缺陷。?方法：應(yīng)用外周血培養(yǎng)和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，對220例無精子、嚴(yán)重少精子患者的染色體和11個AZF基因位點(diǎn)進(jìn)行檢查。結(jié)果：在140例無精子患者中，發(fā)現(xiàn)19例患者染色體異常，異常率為13.57%。有21例患者有AZF基缺失，總?cè)笔蕿?0.31%，AZFa、AZFb、AZFc缺失率分別為2.38%、4.76%、16.67%。在80例嚴(yán)重少精子患者中，有14例

2、患者有AZF基因缺失，總?cè)笔蕿?7.50%，AZFb和AZFc的基因片段缺失率分別為1.25%和17.50%。未發(fā)現(xiàn)有染色體異常和AZFa缺失。結(jié)論：染色體異常和無精子基因微缺失是導(dǎo)致無精子癥、少精子癥主要因素，遺傳學(xué)檢查對男性不育患者的病因診斷與治療有著重要價(jià)值?！娟P(guān)鍵詞】不育癥；男性；Y染色體；AZF；無精子癥；少精子癥11已婚育齡夫婦不孕癥的發(fā)病率高達(dá)10%~15%，其中男性不育約占40%，特發(fā)性無精子癥和嚴(yán)重少精子是男性不育的主要類型。引起無精子或嚴(yán)重少精子的原因極其復(fù)雜，遺傳缺陷是其中的重要原因

3、之一。男性無精子和嚴(yán)重少精子患者除染色體異常外，Y染色體長臂有控制精子生成的無精子因子（Azoospermiafactor，AZF），這一區(qū)域的基因微缺失與無精子和嚴(yán)重少精子密切相關(guān)。我們通過對無精子癥和嚴(yán)重少精子患者外周血染色體和Y染色體上AZF缺失的檢測，探討了引起無精子和少精子的遺傳因素和AZF缺失與表型效應(yīng)的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。1材料與方法1.1研究對象來自我院不育門診就診的男性不育患者。根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液常規(guī)分析、果糖測定、精液脫落細(xì)胞學(xué)檢查等，并排除繼發(fā)感染、輸精管缺如、其它睪丸外傷等病

4、癥，經(jīng)確診為無精子或嚴(yán)重少精子病例作為研究對象。無精子癥140例，嚴(yán)重少精子患者80例。按設(shè)計(jì)表格逐一填寫個人一般狀況、個人發(fā)育史、生育史、既往病史、體格檢查等情況。無精子癥和嚴(yán)重少精子病例年齡22~40歲，平均29.03±3.35歲。以我院優(yōu)生門診和沈陽市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科有正常生育史患者的丈夫30例為對照組，以10例正常女性為陰性對照組，年齡24~35歲，平均28.12±2.83歲。1.2方法1.2.1精液分析11根據(jù)世界衛(wèi)生組織精液評估標(biāo)準(zhǔn)，每例患者重復(fù)兩次以上檢測，留取標(biāo)本前應(yīng)禁欲3~5天。無精子患者，

5、經(jīng)連續(xù)三次精液分析，并經(jīng)離心沉淀均無精子者確診為無精子癥，并排除繼發(fā)感染、輸精管缺如、其它睪丸外傷等病癥。精子密度低于5×106/ml為嚴(yán)重少精子癥。1.2.2激素測定采用SEROZYMEI磁分離酶聯(lián)免疫測試儀（瑞士）測定血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）激素，試劑為SEROZYME專用進(jìn)口試劑。1.2.3染色體檢查采用本室常規(guī)外周血染色體檢查方法，鏡下每例計(jì)數(shù)30個分裂相，G染色體顯帶核型分析5個。1.2.4Y染色體上缺失基因檢測1.2.4.1無精子基因引物根據(jù)文獻(xiàn)資料，在Y染色體

6、長臂5~6區(qū)30個基因片段位點(diǎn)分別選擇了引物AZFa區(qū)sY84、sY86，AZFb區(qū)sY102、sY134，AZFc區(qū)sY147、sY153、sY157和RBM，引物由中國科學(xué)院微生物研究所合成。它們的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA長度分別為326bp、320bp、218bp、301bp、100bp、139bp、285bp和825bp。1.2.4.2PCR反應(yīng)檢測分析1）標(biāo)本DNA提?。翰杉颊咄庵苎?ml，肝素抗凝，300011rpm離心20min，取白細(xì)胞層加入等量的裂解緩沖液，充分混懸。15000rpm離心3m

7、in，去上清，沉淀加入1ml裂解液，重復(fù)1~2次，常規(guī)法提取DNA備用。2）反應(yīng)條件：25μl反應(yīng)體系100μl10×緩沖液（10mMTris-HCl，pH8.3，500mMKCl，15mMMgCl2），8μldNTP混合物（每種核苷酸12.5mM），DNA聚合酶8μl（5UI/μl），引物濃度按每反應(yīng)體系50pmol加入超純水295μl；混合后分裝每反應(yīng)管22μl，加入模板DNA3μl。在PE480PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。94℃預(yù)變性5min，94℃30sec，54℃45sec，65℃120sec，共完

8、成45個循環(huán)，最后65℃5min延伸，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置4℃冰箱中儲存。3)產(chǎn)物檢測分析：每PCR反應(yīng)管中加入載樣緩沖液3μl，吸取10μl加樣,用3%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/ml，溴化乙啶）電泳，電壓8伏/cm，在紫外透射儀下觀察結(jié)果。2結(jié)果2.1染色體分析在140例無精子患者中，發(fā)現(xiàn)19例患者染色體異常，異常率為13.57%，其中47，XXY14例，46，XY，del（Yq12）2例，46，XY，del（Yq