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1、DNALadder是一種即用型(readyforuse)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNAMolecularWeightMarker)。包含了1KbDNALadder和100bpDNAladder，可以滿足各種常規(guī)DNA電泳分析的分子量參照需要。本DNAladder相當(dāng)于Invitrogen等公司的1KbplusDNAladder，但比Invitrogen公司的1KbplusDNAladder的條帶分布更加均勻細(xì)致，便于對照DNA分子量。DNAladder中500bp、1000bp和3000bp條帶用黑體標(biāo)記(參見右圖)，亮度較高，使辨別條帶更加容易。具體每條帶的DNA的含量
2、可以參考右圖進(jìn)行計算。本DNAladder中已添加了含有溴酚藍(lán)的DNA上樣緩沖液，可以直接使用。每孔上樣5微升，即可觀察到非常清楚的DNA條帶(參見右圖)。DNAladder法檢測細(xì)胞凋亡發(fā)生細(xì)胞凋亡時，內(nèi)源性核酸酶被激活，染色體DNA鏈在核小體之間被切割，形成180～200個堿基或其整數(shù)倍的DNA片段，將這些DNA片段抽提出來進(jìn)行電泳，可得到DNA梯狀條帶（DNAladder）。【材料與試劑】凋亡細(xì)胞；蛋白酶K（500μg/ml）8mol/L醋酸鉀白細(xì)胞裂解液：pH8.0，10mmol/LTris-HCl，10mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA，1%S
3、DS。氯仿無水乙醇，70%乙醇；2%瓊脂糖凝膠。【操作步驟】（1）收集凋亡細(xì)胞：取1～2×106個細(xì)胞，離心后，立即用70％酒精（-20℃）固定2h；（2）洗滌：取出酒精固定的細(xì)胞，1000r/min離心5min，去掉上清液，PBS洗二次；（3）裂解細(xì)胞：加400μl細(xì)胞裂解液，充分混勻再加蛋白酶K100μl，置65℃水浴消化2小時或過夜；（4）蛋白處理：加75μl8mol/L的醋酸鉀，4℃15min，再加750μl氯仿，充分混勻后，10000r/min離心10分鐘后，將上清移至一新的Eppendorf管中；（5）沉淀DNA:加入750μl無水乙醇，上下輕柔顛倒混合
4、，即可見乳白色沉淀，若不明顯時可置-20℃過夜，12000r/min離心10分鐘，去上清；（6）洗滌DNA：加1ml70%乙醇，混勻，10000r/min離心5min，去上清；（7）溶解DNA：根據(jù)DAN沉淀的大小，加一定量的蒸餾水或TE，37℃溶解；（8）測定DNA濃度；（9）2%瓊脂糖凝膠電泳80V2小時；【結(jié)果判斷】出現(xiàn)梯狀電泳條帶，最小的條帶為180～200bp，其他的條帶為其整倍數(shù)大小。壞死細(xì)胞則出現(xiàn)彌散的電泳條帶，無清晰可見的條帶。正常細(xì)胞DNA基因條帶因分子量大，遷移距離短，故停留在加樣孔附近。細(xì)胞凋亡DNALadder檢測試劑盒細(xì)胞凋亡DNALadd
5、er檢測試劑盒一、原理細(xì)胞核染色質(zhì)DNA斷裂是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志特征。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，核酸內(nèi)切酶被激活，選擇性降解染色質(zhì)DNA，形成50-300kb的大片段，并進(jìn)而在核小體連接處斷裂，形成180-200bp或其整倍數(shù)的DNA片段，這些DNA片段可從細(xì)胞中提取出來，通過瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色呈現(xiàn)為梯狀條帶（DNALadder），并據(jù)此判斷細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。細(xì)胞凋亡DNALadder檢測試劑盒提供了一種簡便、快速地提取染色質(zhì)DNA的方法，并增加對小片段DNA的回收，從而增強(qiáng)了檢測的敏感性。二、試劑盒組份組份KGA111（20assays）KGA112（50assays）
6、KGA113（100assays）LysisBuffer6mL15mL25mLSolutionA400μL1.0mL2.0mLEnzymeA400μL1.0mL2.0mLEnzymeB400μL1.0mL2.0mLPrecipitant3.0mL6.5mL13.0mLLoadingBuffer80μL0.2mL0.4mL三、操作步驟1．離心收集105~106細(xì)胞（1500×g，5min）于1.5mL微量離心管中；2．用PBS洗滌細(xì)胞二次（離心1500×g，5min），棄上清；3．沉淀的細(xì)胞中加入100μLLysisBuffer，渦旋振蕩器上劇烈混合10秒，離心100
7、0×g，5min）移上清于另一1.5mL微量離心管中；4．沉淀再加入100μLLysisBuffer重復(fù)上步，合并兩次的上清液；5．在上述合并的上清液中加入20μLSolutionA，再加入20μLEnzymeA，55℃反應(yīng)1小時；6．加入20μLEnzymeB,37℃，1小時；7．加入130μLPrecipitant和950μL冷乙醇,混勻，置—20℃,1小時以上或過夜；8．4℃，12，000-14，000rpm離心15-30min，小心地棄去上清，收集沉淀的DNA；9．加入0.5mL70%的冷乙醇，洗DNA沉淀，再12，000-14，000rpm離心20mi
