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《人肝癌細(xì)胞總rna電轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞的體外腫瘤殺傷實驗》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、人肝癌細(xì)胞總RNA電轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞的體外腫瘤殺傷實驗【摘要】目的：探討人肝癌細(xì)胞總RNA電轉(zhuǎn)染人樹突狀細(xì)胞(DendriticCells,DCs)后誘導(dǎo)特異性效應(yīng)T細(xì)胞及其效應(yīng)T細(xì)胞抗肝癌的特異性。方法：通過密度梯度離心法分離人外周血單核細(xì)胞，采用細(xì)胞因子體外培養(yǎng)誘導(dǎo)其成為未成熟樹突狀細(xì)胞（ImmatureDendriticCell,imDC）和成熟樹突狀細(xì)胞（MatureDendriticCell,mDC）。培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，Trizol一步法提取人肝癌細(xì)胞總RNA。通過電轉(zhuǎn)染法將人肝癌細(xì)胞總RNA導(dǎo)入imDC內(nèi)；觀測電轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染率；采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測電轉(zhuǎn)染前后的imDC
2、形態(tài)及其表面標(biāo)志；通過混合淋巴細(xì)胞實驗，獲取mDC激活的特異性效應(yīng)T細(xì)胞。用MTT法測定效應(yīng)T細(xì)胞的抗肝癌特異性。結(jié)果：電轉(zhuǎn)染方法可將人肝癌細(xì)胞總RNA導(dǎo)入imDC。電轉(zhuǎn)染前后imDC分子表達(dá)無顯著差異，mDC的分子表達(dá)與imDC相比發(fā)生了變化。轉(zhuǎn)染了人肝癌細(xì)胞總RNA的mDC可特異的激活T細(xì)胞為效應(yīng)T細(xì)胞。效應(yīng)T細(xì)胞可特異性的殺傷人肝癌細(xì)胞，而對不相關(guān)的MG-63細(xì)胞無特異性的殺傷作用。結(jié)論：電轉(zhuǎn)染不影響imDC的形態(tài)和原有的蛋白表達(dá)；轉(zhuǎn)染了人肝癌細(xì)胞總RNA的mDC可特異的激活T細(xì)胞為效應(yīng)T細(xì)胞；效應(yīng)T細(xì)胞具有抗人肝癌細(xì)胞的特異性。【關(guān)鍵詞】樹突狀細(xì)胞肝癌細(xì)胞總RNA
3、轉(zhuǎn)染人AbstractObjective:Toinvestiageandendriticcells(DCs)acellscouldinducethespecificeffectiveTcells,thenanalysisthespecificythateffectiveTcellskilltargethepatocarcinomacells.Methods:MonocytesobtainedformhumanperipheralbloodbydensityguadientcentrifugationareinducedintoimmatureDCsandmatureDCs
4、inthepresenceofcytokinesinvitro.ThetotalRNAofhepatocarcinomacellsareextractedbyTrizolandareeletransfectedintomonocyte-derivedimmatureDCs.Thesuccessrateofelectransfectionismeasured.I-1640培養(yǎng)液，購自美國GIBCO公司。淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll，1.077g/mL），購自上海試劑二廠。胎牛血清（FCS），新生牛血清（NCS），購自美國HYClone公司。重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子
5、（rhGM-CSF）、重組人白細(xì)胞介素2（rhIL-2）和重組人白細(xì)胞介素4（rhIL-4），購自德國RD公司。尼龍毛（Scrubbednylonfiber）diameter3，318cm，type200，購自FENHC-Ⅱ、鼠抗人CD86、鼠抗人CD83、鼠抗人S-100、鼠抗人AFP、鼠抗人TERT蛋白單克隆抗體，即用型二步法生物素檢測試劑盒（PV9000）、FITC標(biāo)記的第Ⅱ抗體工作液、磷酸緩沖液（PBS，0.01M，pH7.2～7.4）、多聚賴氨酸、DAB、Triton-100均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。HEPES，購自Sigma公司。TRIZOL試劑盒、綠色
6、熒光蛋白（GFP）mRNA，購自Invitrogen公司。DEPC購自鼎國生物技術(shù)公司。1．2方法1.2.1單核細(xì)胞、imDC的獲得及培養(yǎng)取正常人新鮮外周血200mL，以淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞（PBMNC），在37℃和5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)2h，取貼壁細(xì)胞即單核細(xì)胞，加入RPMI-1640液、10%胎牛血清（FCS）和細(xì)胞因子rhGM-CSF(1000U/mL)；rhIL-4(500U/mL)于37℃和5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。第7d收獲的細(xì)胞為imDC。1.2.2肝癌細(xì)胞株Bel-7402總RNA的獲得：常規(guī)方法對肝癌細(xì)胞株Bel-7402進(jìn)行細(xì)胞
7、培養(yǎng)。以Trizol一步法對培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞進(jìn)行總RNA抽提，-20℃保存。部分用于測定260nm和280nm分光光度值，估計純度并定量，部分進(jìn)行RNA電泳觀察其18S和28S條帶完整性。1.2.3肝癌細(xì)胞總RNA電轉(zhuǎn)染imDC并培養(yǎng)為mDC收集誘導(dǎo)7d的imDC，以無血清培養(yǎng)液洗兩次，調(diào)整細(xì)胞濃度為107個細(xì)胞/mL。人肝癌細(xì)胞總RNA、PBS、GFPmRNA分別以20μg/0.4mL與imDC在電轉(zhuǎn)杯中混合。均在300V、500uS的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)染后靜置5min，將細(xì)胞移出電轉(zhuǎn)杯，用含20%FCSRPMI-1640
