snt 2970-2011 國境口岸蚊類攜帶西部馬腦炎病毒的檢測方法

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1、中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)犛犖／犜２９７０—２０１１國境口岸蚊類攜帶西部馬腦炎病毒的檢測方法犚犜犘犆犚法犇犲狋犲犮狋犻狀犵犿犲狋犺狅犱犳狅狉狑犲狊狋犲狉狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犻狀犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋—犚犜犘犆犚犿犲狋犺狅犱２０１１０５３１發(fā)布２０１１１２０１實施中華人民共和國發(fā)布國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)國境口岸蚊類攜帶西部馬腦炎病毒的檢測方法犚犜犘犆犚法ＳＮ／Ｔ２９７０—２０１１中國標(biāo)準(zhǔn)出

2、版社出版北京復(fù)興門外三里河北街１６號郵政編碼：１０００４５網(wǎng)址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ電話：６８５２３９４６６８５１７５４８中國標(biāo)準(zhǔn)出版社秦皇島印刷廠印刷開本８８０×１２３０１／１６印張０．５字?jǐn)?shù)９千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印數(shù)１—１６００書號：１５５０６６·２２２６６７定價１４．００元犛犖／犜２９７０—２０１１前言本標(biāo)準(zhǔn)按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國遼寧出入境檢驗檢疫局、中國檢

3、驗檢疫科學(xué)研究院、中華人民共和國黑龍江出入境檢驗檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：宋鋒林、耿麗梅、孫時、張曉龍、孫明亮、吳剛、薛芳、劉洪文、高玉峰。Ⅰ犛犖／犜２９７０—２０１１國境口岸蚊類攜帶西部馬腦炎病毒的檢測方法犚犜犘犆犚法１范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了國境口岸蚊類攜帶西部馬腦炎病毒的檢測對象、生物安全要求、樣品的保存運輸、檢測方法和結(jié)果判斷。本標(biāo)準(zhǔn)適用于國境口岸蚊類攜帶西部馬腦炎病毒的檢測。２規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件

4、，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。ＧＢ１９４８９實驗室生物安全通用要求人間傳染的病原微生物名錄（中華人民共和國衛(wèi)生部，２００６年）３術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。３．１西部馬腦炎病毒狑犲狊狋犲狉狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊；犠犈犈犞西部馬腦炎病毒為披膜病毒科甲病毒屬病毒，具有甲病毒的一般形態(tài)特征。病毒粒子呈球形對稱，有囊膜，直徑４０ｎｍ。環(huán)跗庫蚊（犆狌犾犲狓狋犪狉狊犪犾犻狊）、背點伊蚊（犃犲犱犲狊犱狅狉狊犪犾犻狊）等蚊蟲為本病毒的主要傳播媒介。４檢測對象出入境交通

5、工具、集裝箱、貨物以及口岸等場所捕獲的媒介蚊蟲。５生物安全要求實驗室生物安全要求按照ＧＢ１９４８９及《人間傳染的病原微生物名錄》的規(guī)定執(zhí)行。６器材與試劑６．１器材液氮罐、冷藏箱、高速冷凍離心機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋、ＰＣＲ擴(kuò)增儀、烘箱、水浴鍋、生物安全柜、勻漿器、移液器、ＰＣＲ反應(yīng)管、凍存管、離心管、塑料平皿、鑷子等。１犛犖／犜２９７０—２０１１６．２試劑Ｔｒｉｚｏｌ、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）、引物、緩沖液、ＡＭＶ逆轉(zhuǎn)錄酶、ＤＮＡ聚合酶、ＲＮＡ酶抑制劑等。７樣品的保存運輸７．１樣品

6、的分揀、分裝將捕獲的蚊蟲現(xiàn)場用三氯甲烷熏殺后，快速分揀。若條件允許，分揀過程應(yīng)在簡易低溫裝置上進(jìn)行。分揀后按類別裝入適當(dāng)?shù)娜萜鳎ㄈ纾簝龃婀?、離心管、塑料平皿等），加貼標(biāo)簽。標(biāo)簽內(nèi)容至少包括以下信息：編號、種類、采集時間、采集地點、采集人等。７．２樣品的保存運輸（物理法）分裝完畢的樣品，盡快裝入液氮罐、冷藏箱或其他適當(dāng)?shù)睦鋬觯ɡ洳兀┭b置，盡早送實驗室處理。若采樣點與實驗室相距較近，也可將活體樣品連同采樣工具直接送實驗室處理。運送過程中防止蚊蟲逃逸。７．３樣品的保存運輸（化學(xué)法）在裝有蚊蟲的密閉容器內(nèi)加入５

7、倍體積的ＲＮＡ保護(hù)劑，常溫下５ｄ內(nèi)送達(dá)實驗室。８樣品的檢測８．１核酸（犚犖犃）提?。福保睜覡螤撂崛》椒ㄊ褂茫裕颍椋铮煸噭┨崛】偅遥危?。可參照如下方法提取總ＲＮＡ，或使用可達(dá)到同等效果的ＲＮＡ提取試劑盒：８．１．１．１取蚊蟲個體（單只或多只）放入１．５ｍＬ離心管內(nèi)，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ試劑后研磨成勻漿，室溫放置５ｍｉｎ。８．１．１．２加入２００μＬ三氯甲烷，劇烈振蕩１５ｓ，室溫放置３ｍｉｎ，于４℃１２０００犵離心１５ｍｉｎ。８．１．１．３小心吸出上清液，置于另一１．５ｍＬ離心管中，加入異丙醇５００

8、μＬ，室溫放置１０ｍｉｎ，４℃１２０００犵離心１０ｍｉｎ。８．１．１．４棄上清液，加入７５％乙醇１ｍＬ洗滌，４℃７５００犵離心５ｍｉｎ。８．１．１．５棄上清液，將沉淀自然干燥，加入適量的ＤＥＰＣ水溶解沉淀。８．１．１．６－７０℃凍存提取的ＲＮＡ或直接用于反轉(zhuǎn)錄實驗。８．１．２注意事項ＲＮＡ提取過程中注意事項如下：ａ）ＲＮＡ的提取既可單只蚊蟲進(jìn)行，也可多只蚊蟲混合提取。根據(jù)捕獲樣品數(shù)量、實驗?zāi)康牡染唧w情況確定。ｂ）樣品研磨前的分裝過程，注意低