snt 2969-2011 國境口岸蚊類攜帶東部馬腦炎病毒的檢測方法

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1、版權所有·禁止翻制、電子發(fā)售中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準犛犖／犜２９６９—２０１１國境口岸蚊類攜帶東部馬腦炎病毒的檢測方法犚犜犘犆犚法犇犲狋犲犮狋犻狀犵犿犲狋犺狅犱犳狅狉犲犪狊狋犲狉狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犻狀犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆犪狉狋—犚犜犘犆犚犿犲狋犺狅犱２０１１０５３１發(fā)布２０１１１２０１實施中華人民共和國發(fā)布國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局版權所有·禁止翻制、電子發(fā)售中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準國境口岸蚊類攜帶東部馬腦炎病毒的檢測方法犚犜犘犆犚法ＳＮ／Ｔ２９６９

2、—２０１１中國標準出版社出版北京復興門外三里河北街１６號郵政編碼：１０００４５網址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ電話：６８５２３９４６６８５１７５４８中國標準出版社秦皇島印刷廠印刷開本８８０×１２３０１／１６印張０．５字數９千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印數１—１６００書號：１５５０６６·２２２６６８定價１４．００元版權所有·禁止翻制、電子發(fā)售犛犖／犜２９６９—２０１１前言本標準按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９給出的規(guī)則起草。本標準由國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標準起草單位：中華人民共和國遼寧出入境檢

3、驗檢疫局、中國檢驗檢疫科學研究院、中華人民共和國江蘇出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國浙江出入境檢驗檢疫局。本標準主要起草人：薛芳、孫時、耿麗梅、田虹、宋鋒林、張曉龍、高玉峰、孫立新、吳忠華、郭天宇。Ⅰ版權所有·禁止翻制、電子發(fā)售犛犖／犜２９６９—２０１１國境口岸蚊類攜帶東部馬腦炎病毒的檢測方法犚犜犘犆犚法１范圍本標準規(guī)定了國境口岸蚊類攜帶東部馬腦炎病毒的檢測對象、生物安全要求、樣品的保存運輸、檢測方法和結果判斷。本標準適用于國境口岸蚊類攜帶東部馬腦炎病毒的檢測。２規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件

4、，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。ＧＢ１９４８９實驗室生物安全通用要求人間傳染的病原微生物名錄（中華人民共和國衛(wèi)生部，２００６年）３術語和定義下列術語和定義適用于本文件。３．１東部馬腦炎病毒犲犪狊狋犲狉狀犲狇狌犻狀犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊；犈犈犈犞東部馬腦炎病毒屬披膜病毒科甲病毒屬，病毒粒子呈圓形，核衣殼呈２０面體對稱，直徑５０ｎｍ～７０ｎｍ，含有一個高電子密度的核心，是引起人類東部馬腦炎的病原體。黑尾賽蚊（犆狌犾犻狊犲狋犪犿犲犾犪狀狌狉犪）、鹽澤伊蚊（犃犲犱犲

5、狊狊狅犾犾犻犮犻狋犪狀狊）等蚊蟲為本病毒的主要傳播媒介。４檢測對象出入境交通工具、集裝箱、貨物以及口岸等場所捕獲的媒介蚊蟲。５生物安全要求實驗室生物安全要求按照ＧＢ１９４８９及《人間傳染的病原微生物名錄》的規(guī)定執(zhí)行。６器材與試劑６．１器材液氮罐、冷藏箱、高速冷凍離心機、高壓蒸汽滅菌鍋、ＰＣＲ擴增儀、烘箱、水浴鍋、生物安全柜、勻漿器、移液器、ＰＣＲ反應管、凍存管、離心管、塑料平皿、鑷子等。１版權所有·禁止翻制、電子發(fā)售犛犖／犜２９６９—２０１１６．２試劑Ｔｒｉｚｏｌ、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）、引物、緩沖液、混合

6、酶、ＲＮＡ酶抑制劑等。７樣品的保存運輸７．１樣品的分揀、分裝將捕獲的蚊蟲現(xiàn)場用二氯甲烷熏殺后，快速分揀。若條件允許，分揀過程應在簡易低溫裝置上進行。分揀后按類別裝入適當的容器（如：凍存管、離心管、塑料平皿等），加貼標簽。標簽內容至少包括以下信息：編號、種類、采集時間、采集地點、采集人等。７．２樣品的保存運輸（物理法）分裝完畢的樣品，盡快裝入液氮罐、冷藏箱或其他適當的冷凍（冷藏）裝置，盡早送實驗室處理。若采樣點與實驗室相距較近，也可將活體樣品連同采樣工具直接送實驗室處理。運送過程中防止蚊蟲逃逸。７．３樣品的保存運輸（化學法）在裝有蚊蟲的密

7、閉容器內加入５倍體積的ＲＮＡ保護劑，常溫下５ｄ內送達實驗室。８樣品的檢測８．１核酸（犚犖犃）提?。福保睜覡螤撂崛》椒ㄊ褂茫裕颍椋铮煸噭┨崛】偅遥危痢？蓞⒄杖缦路椒ㄌ崛】偅遥危粒蚴褂每蛇_到同等效果的ＲＮＡ提取試劑盒：８．１．１．１取蚊蟲個體（單只或多只）放入１．５ｍＬ離心管內，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ試劑后研磨成勻漿，室溫放置５ｍｉｎ。８．１．１．２加入２００μＬ二氯甲烷，劇烈振蕩１５ｓ，室溫放置３ｍｉｎ，于４℃１２０００犵離心１５ｍｉｎ。８．１．１．３小心吸出上清液，置于另一１．５ｍＬ離心管中，加入異丙醇５００μＬ，室溫放置１０ｍ

8、ｉｎ，４℃１２０００犵離心１０ｍｉｎ。８．１．１．４棄上清液，加入７５％乙醇１ｍＬ洗滌，４℃７５００犵離心５ｍｉｎ。８．１．１．５棄上清液，將沉淀自然干燥，加入適量的ＤＥＰＣ水溶解沉淀。８．１．１．６－７０