腦膜炎奈瑟菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作規(guī)范

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1、附件7腦膜炎奈瑟菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作規(guī)范一、腦膜炎奈瑟菌鑒定程序和標(biāo)準(zhǔn)1、腦膜炎奈瑟菌細(xì)菌鑒定程序腦膜炎奈瑟菌的鑒定通常是通過在CAP和BAP上生長(zhǎng)物通過革蘭染色鏡檢和生化反應(yīng)檢測(cè)以確定是否為腦膜炎奈瑟菌，在此基礎(chǔ)上再通過腦膜炎奈瑟菌分群診斷血清進(jìn)行血清分群。BAP,CAP生長(zhǎng)物革蘭氏染色為陰性雙球菌氧化酶反應(yīng)陽性，進(jìn)行生化鑒定陰性，非腦膜炎奈瑟菌生化鑒定（糖氧化）GluMalLacSuc＋＋－－陽性，為腦膜炎奈瑟菌進(jìn)行血清分群陰性，非腦膜炎奈瑟菌A、B、C、H、I、K、L、W135、X、Y、Z、Z′(29E)不同血清群圖xx腦膜炎奈瑟菌鑒定程序2、腦膜炎奈瑟菌感染確診

2、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)疑似流腦病例具有以下實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果之一，即可確診：1.培養(yǎng)：自腦脊液或血液標(biāo)本中分離到腦膜炎奈瑟菌。2.乳膠凝集檢測(cè)：采用乳膠凝集檢測(cè)試劑盒，腦脊液標(biāo)本乳膠凝集檢測(cè)結(jié)果陽性，目前Bio-Rad乳膠凝集檢測(cè)試劑盒能檢測(cè)A群、B群、C群和W135/Y群腦膜炎奈瑟菌感染。1.PCR檢測(cè)：腦脊液標(biāo)本或血液標(biāo)本PCR擴(kuò)增特異性腦膜炎奈瑟菌DNA片段陽性。通過ctrA基因擴(kuò)增，鑒定腦膜炎奈瑟菌，通過擴(kuò)增orf-2、siaD(B)、siaD(C)、siaD(Y)、siaD（W135）等基因片段鑒別不同的血清群，或通過Real-timePCR檢測(cè)出特異性基因片段陽性。2.

3、血清IgG抗體滴度4倍增高：恢復(fù)期血清抗體滴度較急性期4倍增高。二、腦膜炎奈瑟菌標(biāo)本接種培養(yǎng)（一）腦脊液標(biāo)本1．腦脊液標(biāo)本預(yù)處理腦脊液標(biāo)本送到實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)立即離心，2000rpm，20min，用巴斯德吸管吸取上清，進(jìn)行乳膠凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗原。離心后的沉淀進(jìn)行劇烈振蕩或充分混合。取1滴沉淀準(zhǔn)備革蘭染色，1滴劃線接種原始培養(yǎng)基。（注意:如果獲得的腦脊液不足1mL則不進(jìn)行離心，直接用其進(jìn)行革蘭染色和涂板培養(yǎng)）。2.腦脊液標(biāo)本初代培養(yǎng)腦膜炎奈瑟菌的初代接種培養(yǎng)基為巧克力瓊脂平板。將離心后的腦脊液標(biāo)本沉淀滴加至巧克力瓊脂平板，取菌環(huán)劃線接種。置5%的CO2孵箱或燃有蠟燭的燭缸中

4、培養(yǎng)。也可將一些沉淀接種備用肉湯培養(yǎng)基（如腦心浸液肉湯培養(yǎng)基），進(jìn)行孵育培養(yǎng)。如果用T-I培養(yǎng)基進(jìn)行運(yùn)輸，在孵育24h后，用無菌的針或注射器轉(zhuǎn)移100μlT-I培養(yǎng)基的液體部分到BAP及CAP上，并劃線分離。3.腦脊液標(biāo)本革蘭染色（Hucker改進(jìn)方法）腦脊液標(biāo)本離心沉淀物革蘭染色或采用乳膠凝集方法檢測(cè)CSF中特殊的抗原成分兩種檢測(cè)方法，可作為流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌引起的細(xì)菌性腦膜炎的初步診斷。即使標(biāo)本培養(yǎng)陰性，革蘭染色或乳膠凝集檢測(cè)結(jié)果陽性或其中任何一個(gè)檢測(cè)結(jié)果陽性即可以作為感染的證據(jù)。（1）腦脊液標(biāo)本離心，2000rpm，20min。（2）酒精清

5、洗并干燥的玻片，滴加1滴～2滴沉淀物，允許多滴匯集成一個(gè)大滴，不要鋪開液體或使用過高濃度的沉淀物?？赡艿那闆r下，在生物安全柜中風(fēng)干玻片。（3）將玻片三次快速通過火焰以固定涂片，不應(yīng)該灼干。也可以使用異丙醇（95％-100％）固定。（4）草酸銨結(jié)晶紫染色玻片，1min。流水沖洗玻片1min，并去除多余的水分。（5）革蘭氏碘液染色玻片，1min。流水沖洗玻片并干燥。（6）95%的乙醇脫色（5s-10s足夠）。（7）番紅精復(fù)染20s-30s或用酚紅復(fù)染10s-15s。流水沖洗玻片并拭干玻片。顯微鏡觀察染色的涂片，用亮視野的透鏡和油鏡。腦膜炎奈瑟菌通常出現(xiàn)在多形核白細(xì)胞內(nèi)或

6、細(xì)胞外，革蘭陰性、咖啡豆形雙球菌。（二）血液標(biāo)本1.接種血培養(yǎng)瓶：采取血液標(biāo)本后直接接種血培養(yǎng)瓶，應(yīng)在培養(yǎng)前排氣，放置在35℃，排氣通常是在血培養(yǎng)瓶的橡膠部分插入一個(gè)塞有棉花的無菌針頭來實(shí)現(xiàn)。2.傳代培養(yǎng)（1）血培養(yǎng)瓶觀察血培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)14h～17h后開始進(jìn)行觀察，以后每天都要進(jìn)行觀察，直至第7天。紅血球發(fā)生任何混濁或溶解都可能是細(xì)菌生長(zhǎng)的指示，應(yīng)該立即進(jìn)行傳代培養(yǎng)。腦膜炎奈瑟菌很脆弱，因此不管血培養(yǎng)瓶的表象是否變化，培養(yǎng)14h～17h、48h和7天時(shí)都應(yīng)進(jìn)行傳代。出現(xiàn)渾濁和細(xì)菌生長(zhǎng)二者并不一定有相關(guān)性，不出現(xiàn)渾濁并不意味著細(xì)菌一定沒有生長(zhǎng)。在傳代前應(yīng)攪動(dòng)瓶子混勻內(nèi)

7、容物。（2）血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種用乙醇和聚烯吡酮碘拭子消毒血培養(yǎng)瓶橡膠塞表面，用帶針頭的注射器從血培養(yǎng)瓶中吸取少量（0.5mL）液體，接種于巧克力瓊脂平板（CAP）和血瓊脂平板(BAP)。當(dāng)只使用一種瓊脂時(shí)，應(yīng)該接種CAP，因?yàn)镃AP含有流感嗜血桿菌生長(zhǎng)所必需的因子，而BAP是沒有的。劃線方式接種瓊脂平板，在CO2空氣中培養(yǎng)至48h。當(dāng)細(xì)菌的生長(zhǎng)已經(jīng)通過血瓊脂傳代而確定時(shí)，則不需要再繼續(xù)培養(yǎng)血培養(yǎng)瓶。瓶子應(yīng)該按照生物安全程序處理。（三）、T-I培養(yǎng)基T-I培養(yǎng)基接種標(biāo)本后，培養(yǎng)24h，用無菌針頭或注射器將100μlT-I培養(yǎng)基液體加至BAP和CAP上，劃線，CO2