酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及其應(yīng)用

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1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及其應(yīng)用作者：鮑行豪一、前言近二十幾年來，免疫學(xué)分析方法發(fā)展很快，特別是在使用標(biāo)記了的抗原和抗體的分析技術(shù)以后，使原來許多經(jīng)典的分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技術(shù)之后，在70年代初期又建立了用酶來標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)。由于酶的高效生物催化作用，一個(gè)酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（Enzyme—LinkedImmunosorbentAss

2、ay，ELISA），本法自70年代初期由VANWEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相繼分別報(bào)道后，現(xiàn)已引起廣泛重視。ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原

3、，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。2、研究抗酶抗體的合成。3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。4、定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。二、方法的基本原理和種類ELISA的基本原理有三條：（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；（2）抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免

4、疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。由于ELISA法一方面是建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。而另一方面又由于酶標(biāo)記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物，它可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，正因?yàn)榇朔N放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一種既敏感又特異的方法。常用的ELISA有以下兩個(gè)方面。(一)測(cè)定抗原的，主要有四種方法。1、競(jìng)爭(zhēng)法（Competitionmethod）:方法的基本原理可見圖1：本法首先將特異性抗體吸附于固相載體

5、表面，我們把抗原和抗體吸附到固相載體表面的這個(gè)過程，稱為包被（Coated），也可叫做致敏。經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為我們所要測(cè)定的未知抗原的量。這種方法所測(cè)定的抗原只要有一個(gè)結(jié)合部位即可，因此，對(duì)小分子抗原如激素和藥物之類的測(cè)定常用此法。該法的優(yōu)點(diǎn)是快，因?yàn)橹挥幸粋€(gè)保溫洗滌過程。但需用較多量的酶標(biāo)記抗原為其缺點(diǎn)。圖1：竟?fàn)幏y(cè)抗原示意圖2、雙抗體夾心法方法的基本原理可用圖2來表示圖2.雙抗體夾心法測(cè)抗原示意圖本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)

6、洗滌后加入含有抗原之待測(cè)樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測(cè)定，底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量。這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，因?yàn)槠湟欢艘挥诠滔噍d體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測(cè)定。我們用在霍亂腸毒素的測(cè)定。HbSAg及HbS的測(cè)定。3、改良雙抗體夾心法：本法是雙抗體夾心法的一種改良形式，也是用于測(cè)定抗原的，其原理可用圖3來表示。圖3.改良雙抗體夾心

7、法測(cè)抗原示意圖本法首先是將特異性抗體a包被于固相載體，經(jīng)洗滌加入含有欲測(cè)抗原之待檢樣品。經(jīng)孵育洗滌后再加一次未標(biāo)記的特異性抗體b，而這次加入的抗體b于第一次包被于固相載體上的特異性抗體a對(duì)被測(cè)抗原來說都是特異性的，但不是用同種動(dòng)物免疫制備的，否則可出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。經(jīng)孵育洗滌后，再加酶標(biāo)記抗b抗體，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色進(jìn)行測(cè)定。這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數(shù)更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。同時(shí)避免標(biāo)記特異性抗體，而另一優(yōu)點(diǎn)是只要標(biāo)記一種抗抗體，即可達(dá)到多種應(yīng)用。用于測(cè)定抗原的尚有第4種叫做抑制性測(cè)定法（見圖4），它是

8、先用抗原包被固相載體，然后分為二組，一組加入用參考抗體和被檢標(biāo)本混合孵育后的混合