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1、Westernblot的操作步驟（時間:2009-3-1617:07:59）???一個基因表達終極結果是產生相應的蛋白質（或酶）。因此檢測蛋白質是測定基因表達的主要標志，檢測蛋白質的方法很多，除ELISA法外，也可用與檢測DNA和RNA相類似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸稱為Western（西）印跡法，該法能用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結合的專一性蛋白質。將聚丙烯酰胺凝膠上分辨出的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上并與第一抗體共孵。第一抗體專一地與待分離蛋自質的抗原決定簇結合，然后用另
2、一種蛋自質，如135I-蛋白A或辣根過氧化物酶連接的山羊抗IgG檢測已結合上去的抗體。本法所需時間6小時或過夜。(一)蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳???幾乎所有蛋白質電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進行，而所用條件總要確保蛋白質解離成單個多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。最常用的方法是將強陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，并通過加熱使蛋白質解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結合并因此而帶負電荷，由于多肽結合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關，因此SDS多肽復合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與
3、多肽的大小相關。在達到飽和的狀態(tài)下，每克多肽約可結合1.4克去污劑，借助已知分子量的標準參照物，則可測算出多肽鏈的分子量。???SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強度不同于配膠緩沖液，當兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動界面，并帶動加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復合物向前推進。樣品通過高度多孔性的積層膠后，復合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。曲于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復合物全部濃縮于極小體積的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。???最
4、廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)設計的，樣品和積層膠中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分離膠中含Tris-Cl(pH8.8)的。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1％的SDS(Laemmli,1970)，樣品和積層膠中的氯離干形成移動界面的先導邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導較低而電位滴度較陡的區(qū)域，它推動樣品中的多肽前移并在分離膠前沿積聚，此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿
5、過堆集的多肽并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS多肽復合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離?！静牧稀糠蛛x膠及積層膠溶液水飽和異丁醇1×Tris·Cl/SDS,pH8.8蛋白質分子量標準混合物1×SDS電泳緩沖液電泳裝置及夾子、玻璃板、灌膠支架、緩沖液槽等附件0.75mm封邊墊片0.75mm樣品梳子50μl微量進樣器恒流電源【常用試劑】1）30%丙烯酰胺/0.8%N,N’-亞甲丙烯酰胺???將30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml
6、的水中，加熱至37℃溶解之，補加水至終體積為100ml。0.45μm微孔濾膜過濾除菌，查證該溶液pH應不大于7.0，置棕色瓶中保存。小心：丙烯酰胺具有很強的神經毒性并可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺時應戴手套和面具。可認為聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能含有少量未聚合材料。2）4×Tris·Cl/SDS,pH8.8,???在300mlH2O中溶解91gTris堿(1.5mol/L)，用1mol/L調節(jié)pH至8.8,補加H2O至體積500ml。用0.45um濾膜過濾溶液
7、，再加入2gSDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。3）4×Tris·Cl/SDS,pH6.8,???在40mlH2O中溶解6.05gTris堿(0.5mol/L)，用1mol/L調節(jié)pH至6.8,補加H2O至體積100ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入0.4gSDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。4）4×SDS電泳緩沖液Trisbase??24.2gGlycerin??115.3g20%SDS??20ml加水至總體積1000ml。應用時稀釋4倍即為1×SDS電泳緩沖液(Tris0.05M,G
8、lycerin0.38M,SDS0.1%)。5）TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)???TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺的聚合。6）10%過硫酸銨???過硫酸銨提供驅動丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基?？捎萌ルx子水配制小量10%(w/v)的貯存液并保存于4℃。由于過硫酸銨會緩慢分解，
