實(shí)驗(yàn)十一 血清alt測(cè)定

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1、實(shí)驗(yàn)十一血清ALT測(cè)定(賴氏法)【目的】1.了解血清ALT活性測(cè)定的原理及測(cè)定方法。2.掌握血清ALT活性測(cè)定的臨床意義?!驹怼勘彼崤cα-酮戊二酸在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的作用下生成丙酮酸和谷氨酸。在反應(yīng)到達(dá)規(guī)定時(shí)間時(shí),加入2,4-二硝基苯肼-鹽酸溶液以終止反應(yīng)。生成的丙酮酸與2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙。后者在堿性條件下顯棕紅色。根據(jù)顏色的深淺,求得血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活力。反應(yīng)式如下:【器材】試管、刻度吸管、恒溫水浴箱、分光光度計(jì)?!驹噭?.0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4,AR)11.928g,磷

2、酸二氫鉀(KH2PO4,AR)2.176g,加少量蒸餾水溶解并稀釋至1000ml。2.ALT底物液稱取α-酮戊二酸29.2mg,DL丙氨酸1.79g于燒瓶中,加0.1mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液80ml,煮沸溶解后冷卻,用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.4(約加入0.5ml),再用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液在容量瓶?jī)?nèi)加至100ml,混勻,加氯仿數(shù)滴,置冰箱可保存數(shù)周。3.丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(2μmol/ml)精確稱取丙酮酸鈉(AR)22.0mg于100ml容量瓶中,加0.1mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液至刻度。4.2,4-二硝基苯肼溶液稱取2,4-二硝基苯肼19.8mg,用1

3、0mol/L鹽酸10ml溶解后,加蒸餾水至100ml,置棕色瓶?jī)?nèi),冰箱保存。5.0.4mol/LNaOH溶液稱取16gNaOH溶于適量蒸餾水中,然后稀釋至1000ml?!静僮鳌咳?支試管按下表操作:表3-15血清ALT測(cè)定(賴氏法)操作步驟加入物(ml)測(cè)定管對(duì)照管血清0.10.1ALT底物液0.5-混勻,置37oC水浴,保溫30分鐘2,4-二硝基苯肼0.50.5ALT底物液-0.5混勻,置37oC水浴,保溫20分鐘0.4mol/LNaOH5.05.0混勻,靜置10分鐘,用505nm波長(zhǎng)比色,以蒸餾水調(diào)零,讀取各管吸光度,用測(cè)定管吸光度值減去對(duì)照管吸光度值,查標(biāo)準(zhǔn)曲線得ALT活力

4、單位?!緲?biāo)準(zhǔn)曲線繪制】見(jiàn)下表:表3-16血清ALT測(cè)定(賴氏法)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制操作步驟加入物(ml)管號(hào)012345丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(2μmol/ml)00.050.100.150.200.25ALT底物液0.050.450.400.350.300.250.1mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.10.1混勻,置37oC水浴,保溫30分鐘2,4-二硝基苯肼0.050.050.050.050.050.05混勻,置37oC水浴,保溫20分鐘0.4mol/LNaOH5.05.05.05.05.05.0相當(dāng)于ALT單位0285797150200混勻,靜置10分鐘,用505

5、nm波長(zhǎng)比色,以蒸餾水調(diào)零,讀取各管吸光度,將各管吸光度值減去“0”號(hào)管吸光度值,以吸光度為縱坐標(biāo),各管相應(yīng)的酶活性單位為橫坐標(biāo),繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線?!菊⒖挤秶?~25卡門(mén)氏單位賴氏法的酶活力單位是根據(jù)本法中丙酮酸量及其吸光度值與卡門(mén)氏單位的對(duì)等關(guān)系,套用卡門(mén)氏單位而來(lái)??ㄩT(mén)氏單位的定義是:血清1ml,反應(yīng)液總量3ml,反應(yīng)溫度25℃,波長(zhǎng)340nm,比色杯光徑1cm,每分鐘吸光度減少0.001為一個(gè)卡門(mén)氏單位?!九R床意義】ALT主要存在各組織細(xì)胞中,以肝細(xì)胞中含量最多,正常情況下只有極少量釋放入血,血清中ALT活性很低。當(dāng)肝細(xì)胞病變、壞死或肝細(xì)胞膜通透性增加時(shí),ALT可大量釋

6、放入血,使血中該酶的活性顯著升高,故此酶是判斷肝細(xì)胞損傷的一個(gè)常用的指標(biāo)。急性肝炎、藥物中毒性肝細(xì)胞壞死時(shí),血清ALT活性明顯升高;肝癌、肝硬化、慢性肝炎、心肌梗死時(shí),血清ALT活性中度升高;阻塞性黃疸、膽管炎時(shí),血清ALT活性輕度升高?!窘Y(jié)果及分析】【思考題】1.血清ALT活性升高有何臨床意義?2.簡(jiǎn)述ALT測(cè)定的實(shí)驗(yàn)原理。(楊友誼)

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