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1、實驗六血清ALT活性測定一、何謂ALT？谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamicpyruvictransaminase，GPT）丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase，ALT）復習：反應式大多數(shù)氨基酸可參與轉(zhuǎn)氨基作用，但賴氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸除外。二、ALT催化的化學反應:丙氨酸+α-酮戊二酸丙酮酸+谷氨酸ALT三、ALT的分布:主要分布于肝、腎細胞、心肌細胞等，血清中的含量很低。病變時，細胞受損，血清ALT含量升高。四、ALT測定的臨床意義：作為（肝臟）疾病診斷和預后判斷的指標之一。五、測定血清ALT的方法：King法（金氏法）Reit
2、man法（賴氏法）Mohun法（穆氏法）1981年全國生化檢驗方法學討論會確定用賴氏法（改良）作為臨床首選，單位為：卡門氏單位。實驗六血清ALT活性測定---改良賴氏法一、實驗性質(zhì)：分析性二、目的及要求1、掌握ALT測定的原理及臨床意義2、熟習測定的操作方法。丙氨酸+α-酮戊二酸丙酮酸+谷氨酸ALT（血清）基質(zhì)液在一定反應條件下(pH7.4，37℃),作用30min：三、原理：α-酮戊二酸丙酮酸+2,4二硝基苯肼α-酮戊二酸-2,4二硝基苯腙丙酮酸-2,4二硝基苯腙兩者在堿性條件下呈紅棕色，等摩爾濃度條件下，丙酮酸OD值大a-酮戊二酸3倍。四、試劑：省略
3、2、按下表操作：加入物（ml）對照管(B)測定管(U)血清0.10.1基質(zhì)緩沖液—0.5混勻，37℃水浴30min（準確記時）2,4—二硝基苯肼溶液0.50.5基質(zhì)緩沖液0.5—混勻，37℃水浴20min；各管加入0.4MNaOH5.0ml，室溫放置10min；在波長505nm處，以蒸餾水校正零點，讀取各管吸光度；根據(jù)(AU--AB)標準曲線，得到酶活性的卡門氏單位數(shù)。1、將基質(zhì)緩沖液和血清在37℃水浴箱預溫5min。五、操作步驟：3、標準曲線的繪制：管號01234磷酸鹽緩沖液（ml）0.100.100.100.100.10丙酮酸標準液（ml）—0.05
4、0.100.150.20基質(zhì)緩沖液（ml）0.500.450.400.350.30相當于酶活性（卡門氏單位）—285797150各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml，混勻，37℃水浴20min；各管加0.4mol/LNaOH溶液5.0ml，混勻，室溫放置10min。波長505nm處比色，以蒸餾水調(diào)零點，讀取各管吸光度；各管讀數(shù)均減去0號管吸光度，所得差值與對應的卡門氏酶活性單位作圖即成標準曲線。六、結(jié)果分析：正常參考值：5～25卡門氏單位七、注意事項：1．一般血清標本內(nèi)源性酮酸很少，血清對照管吸光度讀數(shù)接近試劑空白管(以0.1ml蒸餾水或生理鹽水代替血
5、清，其它和對照管同樣操作)，所以大批標本測定時，一般不需要每一標本都作血清對照管，以試劑空白管代替即可。但建議對超過正常的標本進行復查，復查時每份標本應作對照管。2．嚴重脂血癥或黃疸、溶血的血清可能會引起測定管吸光度增加，因此檢測此類標本時，應作血清對照管。3．賴氏法原法標準曲線只到97卡門氏單位，直線關系很好。超過此活力的標本應稀釋后再測，臨床上應用甚為不便，故衛(wèi)生部臨檢中心推薦法建議標準曲線延長到150卡門氏單位，實際已不完全成直線了，只能大致反應酶活性的大小、當血清標本酶活性超過150卡門氏單位時，應將血清用生理鹽水或緩沖液稀釋5倍后再進行測定。4
6、．加入2,4-二硝基苯肼溶液后需充分振蕩混勻，否則會影響重復性；加氫氧化鈉溶液方法要一致，不同方法也會導致吸光度讀數(shù)的差異。5．基質(zhì)緩沖液和2,4-二硝基苯肼溶液配制必須準確，每次測定時空白管吸光度上下波動不應超過0.015，如超出此范圍應檢查試劑及儀器等方面的問題。八、實驗報告：九、思考題：1、實驗目的及要求：2、實驗原理：3、材料與方法：只寫自己所完成的操作4、實驗結(jié)果：原始結(jié)果、計算結(jié)果、標準曲線5、體會：結(jié)合具體情況
