瞬時轉(zhuǎn)染原理及實驗步驟

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1、活性蛋白整體方案ActiveProteinSolutions瞬時轉(zhuǎn)染原理及實驗步驟哺乳動物細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染能在短期內(nèi)快速表達(dá)高活性蛋白而被廣泛應(yīng)用。本文主要介紹了細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染的步驟、原理，及血球計數(shù)板對細(xì)胞計數(shù)的原理和方法。哺乳動物細(xì)胞自身具有蛋白折疊和翻譯后修飾的功能，獲得的蛋白更具有天然活性。哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白的方式有兩種：瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染的特點是短期快速表達(dá)，滿足蛋白的小量制備。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通過構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系能夠滿足蛋白的大量、長期生產(chǎn)。瞬時轉(zhuǎn)染是指將構(gòu)建好的質(zhì)粒通過某種方式導(dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞內(nèi)（主要指

2、HEK293細(xì)胞），該質(zhì)粒上的外源基因不整合到細(xì)胞自身的基因組上。隨著細(xì)胞的生長分裂，外源基因會逐漸丟失。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)能夠存在3-4天，此時間內(nèi)，質(zhì)粒外源基因在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯，得到極為少量的蛋白。這一整個快速轉(zhuǎn)染得到蛋白的過程就稱為瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)。瞬時轉(zhuǎn)染步驟瞬時轉(zhuǎn)染流程簡圖細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細(xì)胞株解凍并重新培養(yǎng)的過程。細(xì)胞復(fù)蘇的關(guān)鍵是快速。防止在解凍過程中，產(chǎn)生的水珠形成冰晶損傷細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇一般步驟如下：Tel:（025）5889-4959www.DetaiBio.comOrder

3、@DetaiBio.com活性蛋白整體方案ActiveProteinSolutions1.預(yù)先加熱水浴鍋，溫度至37-40℃，并在離心管中準(zhǔn)備好10mL培養(yǎng)基2.從液氮罐或冰箱中取出細(xì)胞，迅速放進(jìn)預(yù)熱的水浴鍋中，鑷子夾住凍存管晃動，使其受熱均勻3.當(dāng)凍存管內(nèi)完全融化時，注意用酒精擦拭凍存管消毒，將液體倒入含有10mL培養(yǎng)基的離心管中4.離心5min，去除上清，得到沉淀5.用培養(yǎng)基懸浮沉淀，并接種到培養(yǎng)瓶常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇后，生長一段時間，95%的細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞狀態(tài)良好，說明細(xì)胞復(fù)蘇成功。瞬轉(zhuǎn)步驟以Lipofec

4、tamine轉(zhuǎn)染試劑為例的操作流程，不同轉(zhuǎn)染試劑參考說明書51.將復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞按照1-3x10接種到6孔板中，加入2-4mL的完全培養(yǎng)基，混勻放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜2.無菌狀態(tài)下配置如下溶液：a用100ul的無血清培養(yǎng)基稀釋2ug的待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒b用100ul的無血清培養(yǎng)基稀釋25ul的Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑（血清的存在會影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，因此要使用無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染）3.將ab溶液混合并搖勻，室溫下放置30min左右4.細(xì)胞培養(yǎng)至80%單層左右，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1mL的

5、無血清培養(yǎng)基，并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向輕搖混勻，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時5.將轉(zhuǎn)染液倒出，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4天后檢測蛋白表達(dá)量轉(zhuǎn)染檢測收集培養(yǎng)的細(xì)胞，采用超聲或酶解的方法破碎細(xì)胞，離心得到上清。轉(zhuǎn)染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。針對基因水平，使用普通PCR或RT-PCR進(jìn)行驗證。蛋白水平，使用westernblot檢測。細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞計數(shù)的原理就是測定單位體積內(nèi)細(xì)胞的數(shù)量從而得到細(xì)胞總濃度，在細(xì)胞培養(yǎng)和測定細(xì)胞生長曲線的過程中廣泛應(yīng)用。本實驗是采用血球計數(shù)板對

6、細(xì)胞計數(shù)，步驟如下：1.將計數(shù)板的蓋玻片洗凈晾干，并消化細(xì)胞離心加入培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，制得細(xì)胞懸液2.稀釋細(xì)胞懸液，按照一定的倍數(shù)Tel:（025）5889-4959www.DetaiBio.comOrder@DetaiBio.com活性蛋白整體方案ActiveProteinSolutions3.蓋玻片蓋上計數(shù)板表面，移液器吸取10ul左右的細(xì)胞懸液從血球計數(shù)板的一方慢慢注入到計數(shù)板上4.蓋玻片具有引流的功能，因此只需輕輕打入到板上孔中即可5.顯微鏡下觀察細(xì)胞，按照要求計數(shù)該血球計數(shù)板上的細(xì)胞個數(shù)，計數(shù)方式如圖所示圖3

7、血球計數(shù)室表面每個血球計數(shù)板有上下兩個計數(shù)室（如圖1）每個計數(shù)室分為九大格（如圖3）其中最中間的方格分為25個中格，每個中格又被分為16個小格，因此計數(shù)室中一共有400個小格。每次計數(shù)時選取圖3中紅色部分計數(shù)，計數(shù)結(jié)果乘以5得到一個計數(shù)室中總的細(xì)胞個數(shù)Tel:（025）5889-4959www.DetaiBio.comOrder@DetaiBio.com活性蛋白整體方案ActiveProteinSolutionsTel:（025）5889-4959www.DetaiBio.comOrder@DetaiBio.com