病毒轉(zhuǎn)染原理及步驟

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1、病毒轉(zhuǎn)染原理及步驟在細胞相關(guān)的實驗操作中，對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細胞，通過病毒介導(dǎo)的實驗?zāi)軌虼蟠筇岣呋虻霓D(zhuǎn)導(dǎo)效率，以達到目的基因的高效瞬時表達。病毒轉(zhuǎn)染包括以下步驟：1構(gòu)建載體2包裝提純病毒3感染靶細胞。以慢病毒為例。慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞

2、、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。一、慢病毒載體構(gòu)建原理：慢病毒載體的包裝系統(tǒng)一般由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。將包裝成分與載體成分的多個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細胞，即可在細胞上清中收獲攜帶目的基因的復(fù)

3、制缺陷型慢病毒載體顆粒。慢病毒表達載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應(yīng)分子。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就

4、為RNAi，cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。對進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選，為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液提供基礎(chǔ)。二、慢病毒載體構(gòu)建及包裝流程：（一）實驗流程（1和2為并列步驟）1.慢病毒過表達質(zhì)粒載體的構(gòu)建設(shè)計上下游特異性擴增引物，同時引入酶切位點，PCR(采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%)從模板中（CDNA質(zhì)?；蛘呶膸欤┱{(diào)取目的基因CDS區(qū)（codingsequence）連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝入慢病毒過表達質(zhì)粒載體。2.慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建合成siRNA對應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒

5、干擾質(zhì)粒載體3.慢病毒載體的包裝與濃縮純化制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后6h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。（一）實驗材料：慢病毒載體、包裝細胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2,pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達框能表達綠色熒光蛋白（GFP）。細胞株293T，慢病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，生長培養(yǎng)基為D

6、MEM(含10%FBS)。貼壁細胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細胞。菌株大腸桿菌菌株DH5α。用于擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。三、慢病毒轉(zhuǎn)染細胞實驗方法（一）慢病毒轉(zhuǎn)染貼壁細胞實驗方法1、慢病毒轉(zhuǎn)染前18-24小時，將貼壁細胞以1×105/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時的數(shù)量為2×105/孔左右。2、第二天，用含有6μg/mlpolybrene的2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液。37℃孵育。3、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時，用新鮮培養(yǎng)基替換含

7、有病毒的培養(yǎng)基。5、繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉(zhuǎn)染48小時后可見明顯熒光表達，72小時后更加明顯。如需FACS檢測轉(zhuǎn)染效率，可在轉(zhuǎn)染后72-96小時進行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉(zhuǎn)染3-4天后開始加藥。（二）慢病毒轉(zhuǎn)染懸浮細胞實驗方法1、在2×105/ml懸浮細胞中加入polybrene至6μg/ml和適量病毒，充分混勻。37℃孵育?；蛘?50g室溫離心4小時(選作，部分難轉(zhuǎn)染的細胞系采用此步驟可以提高轉(zhuǎn)染效率)。2、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后(或離心結(jié)束后)加入等體積新鮮培養(yǎng)基以稀釋poly

8、brene。3、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。中間視細胞生長情況可傳代或換液。