慢病毒轉(zhuǎn)染步驟.doc

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1、轉(zhuǎn)染法步驟：1分至適宜濃度的細(xì)胞到六孔板中，次日細(xì)胞應(yīng)30%~50%融合2.第二天，吸掉板中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基并加入新的含聚凝胺的培養(yǎng)基，加入適當(dāng)數(shù)量的病毒于細(xì)胞中（見(jiàn)“決定慢病毒效價(jià)”部分），每孔溶液終體積為3ml注意：考慮到細(xì)胞在自旋過(guò)程中不一定能完全被培養(yǎng)基覆蓋，不推崇減少六孔板中的溶液終體積。調(diào)整孔中聚凝胺的終濃度為8mg/ml.通過(guò)渦旋六孔板輕輕地混合培養(yǎng)基，病毒以及聚凝胺。3.為減少自旋-轉(zhuǎn)染過(guò)程中懸浮物質(zhì)的形成以及孔與孔之間液體接觸的情況發(fā)生，用無(wú)菌微孔密封膜封閉六孔板（直接蓋在板上），封閉好后，再在

2、密封膜上加上一層未經(jīng)滅菌的密封箔，最后蓋上六孔板蓋。4.在標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)離心機(jī)中，37°C，2250rpm（1200g）條件下自旋-轉(zhuǎn)染細(xì)胞60min.5.一自旋-轉(zhuǎn)染后就移走密封膜和密封箔，將孔中原有的培養(yǎng)基換為新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基（每孔2ml就足夠）6.轉(zhuǎn)染24h后，吸掉孔中的培養(yǎng)基并每孔加入新鮮的含有嘌呤霉素的2ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基。注意：嘌呤霉素的濃度應(yīng)被每個(gè)細(xì)胞株充分利用，一般規(guī)定在1-5μg/mL7.進(jìn)一步的培養(yǎng)時(shí)間主要取決于細(xì)胞株的類型以及轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)分析。通常，嘌呤霉素篩選細(xì)胞需要大約48h。下面推薦的

3、是結(jié)合給定的細(xì)胞株和分析實(shí)驗(yàn)來(lái)得到的嘌呤霉素篩選時(shí)間>轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)分析嘌呤霉素篩選細(xì)胞時(shí)間>mRNAknockdown(qPCR)2+days>Proteinknockdown(Western)3+days>Phenotypicassay表型分析3+days8.檢測(cè)目的感染細(xì)胞的表面分子