《慢病毒轉(zhuǎn)染手冊(cè)》word版

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1、慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。基本概述　　慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，在美國(guó)已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。慢病毒的應(yīng)用　　目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到

2、細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體,然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對(duì)基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長(zhǎng)期阻斷基因表達(dá)的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子來指導(dǎo)RNA合成的，這是因?yàn)镽NA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會(huì)帶polyA尾。當(dāng)RNA聚合酶Ⅲ遇到連續(xù)4個(gè)或5個(gè)T時(shí)，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端形成1~4個(gè)

3、U。U6和H1RNA啟動(dòng)子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動(dòng)子，其特點(diǎn)是啟動(dòng)子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)～21ntRNA和～50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stemloop）。在siRNA表達(dá)載體中，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動(dòng)子分別轉(zhuǎn)錄,然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成siRNA；也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀RNA(smallhairpinRNA,shRNA),載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子和4～5T轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有1~4個(gè)U3’突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA

4、，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達(dá)載體。慢病毒載體　　慢病毒載體（Lentiviralvector）較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá)shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細(xì)胞、干細(xì)胞、受精卵以及分化的后代細(xì)胞中表達(dá)shRNA，實(shí)現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默，為在原代的人和動(dòng)物細(xì)胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動(dòng)物提供了可能性。慢病毒作為siRNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達(dá)沉默的能力，而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所

5、具備的優(yōu)勢(shì)，為基因功能的研究提供了更強(qiáng)有力的工具。慢病毒表達(dá)載體　　包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。慢病毒載體與其它常見病毒載體的特征比較　　目前常用的病毒載體有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞，而且容量有限，

6、腺病毒一般不能整合到染色體上，只能進(jìn)行瞬時(shí)感染。與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒（LV）具有可以感染非分裂期細(xì)胞、容納外源性基因片段大，可以長(zhǎng)期表達(dá)等顯著優(yōu)點(diǎn)。慢病毒不產(chǎn)生任何有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，可作為一種體外基因運(yùn)輸?shù)墓ぞ摺Ｂ《据d體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)能持續(xù)數(shù)月，且無可觀察到的病理學(xué)現(xiàn)象。[1]　　病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒表達(dá)系統(tǒng)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒基因組雙鏈DNA病毒RNA病毒RNA病毒是否整合病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時(shí)表達(dá)外源基因病毒基因組整合于宿主基因組，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因病毒基因組整合于宿主基因組，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因感染細(xì)胞類型感染分裂和不分裂細(xì)胞感染分裂和

7、不分裂細(xì)胞感染分裂細(xì)胞，但在干細(xì)胞中表達(dá)效率低表達(dá)豐度高水平表達(dá)高水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時(shí)間快（1-2天）慢（2-4天）快（1-2天）滴度滴度高達(dá)1012pfu/ml最高可達(dá)109－10TU/ml最高可達(dá)109－10TU/ml克隆容量可插入高達(dá)8kb的外源片段，滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低可插入不超過8kb的外源片段，滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低可插入不超過6kb的外源片段免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性動(dòng)物模型不能得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，效