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《慢病毒轉(zhuǎn)染人骨髓間質(zhì)干細胞研究.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、慢病毒轉(zhuǎn)染人骨髓間質(zhì)干細胞研究【摘要】目的：分離培養(yǎng)人骨髓來源間質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)并進行慢病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)染研究。方法：采取全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人骨髓MSCs。利用脂質(zhì)體法進行慢病毒感染人骨髓MSCs。結(jié)果：分離培養(yǎng)出人骨髓來源的MSCs，并用攜帶綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。結(jié)論：獲得人骨髓MSCs并進行慢病毒載體介導的基因修飾，為間質(zhì)干細胞基因工程和組織工程研究奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】間質(zhì)干細胞;慢病毒;轉(zhuǎn)染 ?。跘bstract］Objectiv
2、e:Toisolateandculturemesenchymalstemcells（MSCs）derivedfromhumanbonemarrowandtransfectthecellsbylentiviralvectors.Methods：ThetissueadherentculturemethodwasusedtoisolateMSCsfromhumanbonemarrow.TheMSCsweretransfectedbylentiviralvectorsusinglipofectamine2000.Results：Humanbo
3、nemarrowMSCsweresuccessfullyisolatedandefficientlytransfectedbyEGFP-expressinglentiviralvectors.Conclusion：HumanbonemarrowMSCshavebeentransfectedbylentivirus,whichwillplayaroleinresearchingonthefunctionofMSCsingeneandtissueengineering. ?。跭eywords］mesenchymalstemcells；le
4、ntiviralvector;transfection 間質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）存在于多種組織，主要包括骨髓、脂肪組織、骨骼肌、肝臟、臍血及外周血等，骨髓是最常用的MSCs體外分離培養(yǎng)的組織來源。MSCs增殖能力強，體內(nèi)外均具有多向分化潛能，基因修飾后保持原有多潛能性的同時可持續(xù)穩(wěn)定表達外源基因；體外轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)一段時間移植至體內(nèi)仍可存活，并能夠遷移至病變部位,因而其成為基因治療研究領(lǐng)域令人關(guān)注的靶細胞［1］。因此，本研究從人骨髓組織中分離培養(yǎng)出MSCs并體外擴增用于慢病毒轉(zhuǎn)染，為進一步利用MS
5、Cs進行基因治療奠定基礎(chǔ)?！ ?材料與方法 1.1標本和主要試劑 成人骨髓（江蘇大學附屬醫(yī)院），慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)FUGW，pCMVR-delta8.9和VSVG（上海醫(yī)學遺傳所惠贈），人胚腎293T（本實驗室保存），胎牛血清和L-DMEM（Gibco公司），胰蛋白酶（Sigma公司），lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司），Polybrene（Sigma公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），RT-PCR試劑盒（Toyobo公司），PCR試劑（Takara公司），質(zhì)粒提取試劑盒（Ax
6、ygen公司），限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ（NEB公司）。引物設(shè)計采用primerpremier5.0軟件，由上海生物工程有限公司合成。6 1.2主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（Forma公司），BeckmanSW28Rotor超速離心機（Beckman公司），PCR儀（ThermoHybaid公司），流式細胞儀(FACSCalibur,BD公司)，倒置式生物顯微鏡(TE300,Nikon公司)，細胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿（Corning公司）?！ ?.3方法 1.3.1人骨髓MSCs的分離擴增根據(jù)本室建立的方法分離培養(yǎng)人骨髓MSCs
7、［2］。主要操作如下：新鮮分離的骨髓液5ml加入含青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液中，用吸管吹打混勻后，800r/min離心10min去除含脂滴上清。細胞沉淀種在含10%胎牛血清的L-DMEM營養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。5d后半量換液,第7～10天后見有較多貼壁細胞后全量換液，此后每3天換液1次。細胞80%左右融合時,用含0.1mmolEDTA-Na2的0.25%胰酶室溫消化,細胞沉淀按1∶3比例傳代。待其生長接近融合層時，即得到人骨髓來源的MSCs?！ ?.3.2人骨髓MSCs表面標志檢測取1×105第3代人骨髓MSCs與
8、FITC或PE標記的鼠抗人CD13，CD29，CD44，CD105，CD31，CD34，HLA-Ⅰ及HLA-DR在4℃作用30min后，經(jīng)流式細胞儀檢測。陰性對照為FITC結(jié)合的鼠IgG1和PE結(jié)合的鼠IgG1?！ ?.
