慢病毒轉(zhuǎn)染人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞研究

《慢病毒轉(zhuǎn)染人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞研究 》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、慢病毒轉(zhuǎn)染人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞研究【摘要】目的：分離培養(yǎng)人骨髓來源間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)并進(jìn)行慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染研究。方法：采取全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人骨髓MSCs。利用脂質(zhì)體法進(jìn)行慢病毒感染人骨髓MSCs。結(jié)果：分離培養(yǎng)出人骨髓來源的MSCs，并用攜帶綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的慢病毒成功感染人骨髓MSCs。結(jié)論：獲得人骨髓MSCs并進(jìn)行慢病毒載體介導(dǎo)的基因修飾，為間質(zhì)干細(xì)胞基因工程和組織工程研究奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】間質(zhì)干細(xì)胞;慢病毒;轉(zhuǎn)染　　〔Ab

2、stract〕Objective:Toisolateandculturemesenchymalstemcells（MSCs）derivedfromhumanbonemarroethodhumanbonemarroine2000.Results：Humanbonemarroanbonemarroesenchymalstemcells；lentiviralvector;transfection　　間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells，MSCs）存在于多種組織，主要包括骨髓、脂肪組織、骨骼肌、肝

3、臟、臍血及外周血等，骨髓是最常用的MSCs體外分離培養(yǎng)的組織來源。MSCs增殖能力強(qiáng)，體內(nèi)外均具有多向分化潛能，基因修飾后保持原有多潛能性的同時可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)外源基因；體外轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)一段時間移植至體內(nèi)仍可存活，并能夠遷移至病變部位,因而其成為基因治療研究領(lǐng)域令人關(guān)注的靶細(xì)胞〔1〕。因此，本研究從人骨髓組織中分離培養(yǎng)出MSCs并體外擴(kuò)增用于慢病毒轉(zhuǎn)染，為進(jìn)一步利用MSCs進(jìn)行基因治療奠定基礎(chǔ)?！　?材料與方法　　1.1標(biāo)本和主要試劑　　成人骨髓（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院），慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)FUGVR-delta8.

4、9和VSVG（上海醫(yī)學(xué)遺傳所惠贈），人胚腎293T（本實驗室保存），胎牛血清和L-DMEM（Gibco公司），胰蛋白酶（Sigma公司），lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司），Polybrene（Sigma公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），RT-PCR試劑盒（Toyobo公司），PCR試劑（Takara公司），質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen公司），限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ（NEB公司）。引物設(shè)計采用primerpremier5.0軟件，由上海

5、生物工程有限公司合成。　　1.2主要儀器　　二氧化碳培養(yǎng)箱（Forma公司），BeckmanSSCs的分離擴(kuò)增根據(jù)本室建立的方法分離培養(yǎng)人骨髓MSCs〔2〕。主要操作如下：新鮮分離的骨髓液5ml加入含青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液中，用吸管吹打混勻后，800r/min離心10min去除含脂滴上清。細(xì)胞沉淀種在含10%胎牛血清的L-DMEM營養(yǎng)液中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。5d后半量換液,第7～10天后見有較多貼壁細(xì)胞后全量換液，此后每3天換液1次。細(xì)胞80%左右融合時,用含0.1mmolEDTA-N

6、a2的0.25%胰酶室溫消化,細(xì)胞沉淀按1∶3比例傳代。待其生長接近融合層時，即得到人骨髓來源的MSCs?！　?.3.2人骨髓MSCs表面標(biāo)志檢測取1×105第3代人骨髓MSCs與FITC或PE標(biāo)記的鼠抗人CD13，CD29，CD44，CD105，CD31，CD34，HLA-Ⅰ及HLA-DR在4℃作用30min后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。陰性對照為FITC結(jié)合的鼠IgG1和PE結(jié)合的鼠IgG1?！　?.3.3慢病毒包裝在包裝前1天種植293T細(xì)胞，10cm盤中細(xì)胞密度為6×105個細(xì)胞/盤，含10%FBS的L-

7、DMEM10ml/盤培養(yǎng)過夜。第2天轉(zhuǎn)染前換成無血清培養(yǎng)液，然后將15μgFUGVR-delta8.9，9μg包膜質(zhì)粒VSVG用無血清培養(yǎng)液稀釋至1.5ml，同時將30μl的lipofectamine2000脂質(zhì)體復(fù)合物稀釋至1.5ml，室溫靜置5min后將脂質(zhì)體復(fù)合物加至質(zhì)粒復(fù)合物中，混勻后室溫靜置15min。將上述混合體系加入293T細(xì)胞中，8～16h后換成含10%FBS的L-DMEM，每盤10ml，37℃、5％CO2培養(yǎng)。48～72h后收集病毒上清，1000r/min離心15min去除細(xì)胞碎片后，1

8、5000r/min，4℃超速離心2h濃縮病毒，用無血清培養(yǎng)液溶解病毒沉淀后分裝保存于-70℃低溫冰箱?！　?.3.4慢病毒滴度測定滴度測定前1天種293T細(xì)胞，6孔板中細(xì)胞密度為5×104個細(xì)胞/孔，含10%FBS的L-DMEM為2ml/孔，第2天取1μl濃縮病毒液加入事先種好的細(xì)胞中，加入終濃度為8μg/ml的Polybrene置培養(yǎng)體系中以提高感染效率。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1周后用流式細(xì)胞儀檢測陽性率。滴度計算公