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1、慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)的要點(diǎn)：1：良好的293FT細(xì)胞狀態(tài)是轉(zhuǎn)染成功的首要因素，細(xì)胞代數(shù)不宜超過30代；2：細(xì)胞鋪板需均勻，避免細(xì)胞成團(tuán)，影響轉(zhuǎn)染效率；盡量多的細(xì)胞轉(zhuǎn)入質(zhì)粒，產(chǎn)生的病毒就越多；3：細(xì)胞換液和共轉(zhuǎn)染時(shí)，動(dòng)作要輕柔避免細(xì)胞漂浮。盡量少的細(xì)胞死亡，產(chǎn)生的病毒就越多；實(shí)驗(yàn)前要準(zhǔn)備的試劑、耗材和儀器；試劑準(zhǔn)備：10%滅活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培養(yǎng)基,0.25%胰酶，PBS,TRL轉(zhuǎn)染試劑，包裝質(zhì)粒，目的質(zhì)粒，無血清培養(yǎng)基。耗材準(zhǔn)備：10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，吸頭規(guī)格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，離心管規(guī)格15ml、5ml、1.5ml，0.22um
2、PVDF濾膜和10ml無菌注射器，試管架。儀器準(zhǔn)備：倒置熒光顯微鏡，普通光學(xué)倒置顯微鏡，電動(dòng)移液器，吸引器，移液槍，二級(jí)生物安全柜，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱。第一天：上午（病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染前，293FT細(xì)胞復(fù)蘇后至少讓其傳代兩次以上，293FT細(xì)胞能成倍的增長(zhǎng)，確定細(xì)胞狀態(tài)好）；實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：安全柜開紫外燈照30分鐘；把培養(yǎng)基和試劑放置常溫；消化細(xì)胞：??從375%的co2細(xì)胞培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞狀態(tài)良好的293FT細(xì)胞，吸出原培養(yǎng)基，加入PBS1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，輕輕拍打培養(yǎng)皿，再加入3ml新鮮培養(yǎng)基終止消化，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15ml離心管內(nèi)離心1000
3、r/5min,吸出上清液，加入10mlPBS吹打混勻后，離心1000r/5min,?吸出上清液。細(xì)胞鋪板：??在10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上標(biāo)記細(xì)胞名稱、細(xì)胞代數(shù)、時(shí)間和操作人，將計(jì)數(shù)好大約2.5×106個(gè)293FT細(xì)胞吸入15ml離心管，再加入完全培養(yǎng)基至10ml充分混勻，然后把混勻的293FT細(xì)胞移入10cm培養(yǎng)皿）。放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。插入鋪板后圖片剛鋪板后鋪板1天后第三天：上午細(xì)胞轉(zhuǎn)染：細(xì)胞鋪板48h后，從培養(yǎng)箱取出293FT細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞密度達(dá)90%左右；????吸出原有培養(yǎng)基，沿皿壁緩慢加入8ml完全培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱中，待轉(zhuǎn)染。????取出2個(gè)1.5ml的離
4、心管，一份加入142ul的無血清培養(yǎng)基和58ulTRL轉(zhuǎn)染試劑，吹打混勻。另一份加入包裝質(zhì)粒18ul、目的質(zhì)粒10ul和無血清培養(yǎng)基總體積200ul充分混勻。將2個(gè)離心管液體吹打混勻，室溫靜置20分鐘????20分鐘后，取出培養(yǎng)箱中的293FT細(xì)胞，將混合液用200ul的小槍頭輕輕滴入培養(yǎng)皿中,避免細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過程中漂起來，然后輕輕十字混勻，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h。????細(xì)胞培養(yǎng)8h后，吸出原培養(yǎng)基，沿皿壁緩慢加入10ml完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第四天轉(zhuǎn)染24h后取出293FT細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果第五天轉(zhuǎn)染48h后;準(zhǔn)備好1.5ml離心管，10ml無菌注射器和
5、0.22umPVDF濾膜；收集48h后的病毒上清；第六天?轉(zhuǎn)染72h后，收集72h后病毒上清。慢病毒包裝完成后如何用慢病毒感染目的細(xì)胞步驟一:感染前一天用6孔板鋪板，每孔鋪5×10^5個(gè)293FT細(xì)胞，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。步驟二：準(zhǔn)備3個(gè)離心管分別加入1ml、500ul、200ul的病毒液，再依次加入1ml的完全培養(yǎng)基和Polybrene吹打混勻（Polybrene終濃度為8ug/ml）。步驟三：從培養(yǎng)箱中取出6孔板培養(yǎng)的293FT細(xì)胞，吸出原有培養(yǎng)基，再依次加入3個(gè)離心管中的混合液，混勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。步驟四：24h后吸出含病毒的培養(yǎng)基，加入1ml完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)
6、箱中培養(yǎng)48h。步驟五：48h后，帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的病毒，通過倒置熒光顯微鏡觀察感染效率。步驟六：帶Puromycin基因篩選標(biāo)記的病毒，換上終濃度為1ug/ml的Puromycin的培養(yǎng)基,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株(兩至三天換一次液)。72h觀察96h觀察
