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《病毒包裝實驗整體流程及原理(慢病毒、腺病毒).doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在應用文檔-天天文庫。
1、廣州英思特生物科技有限公司為您提供高效快速的病毒包裝實驗外包服務，公司網(wǎng)址：www.insightbiotech.com有需要請聯(lián)系丘先生18925053166病毒感染細胞實驗整體流程及原理目的基因不能直接整合到大多數(shù)真核細胞，常用的手段是將目的基因包裝成病毒來感染細胞，從而得到表達滿足實驗需求。1、病毒的種類病毒有很多種，常見的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆轉錄病毒的一種。構建的siRNA/miRNA慢病毒載體，與化學合成的siRNA和基于瞬時表達載體構建的普通siRNA載體相比，一方面可以擴增替代瞬時表
2、達載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉染試劑難于轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態(tài)的細胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩(wěn)定表達。1.1.2特點1）直接包裝成為假病毒顆粒，對分裂和非分裂細胞均有感染作用，適合RNAi研究和體內(nèi)實驗中難于轉染的細胞(比如神經(jīng)元細胞、干細胞或其它原代細胞)。?2）可以通過簡單方式，在短時間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達特定基因的多種細胞株。3）可用于基因敲除、基因治療和轉基因動物研究。4）無需任何轉染試劑，操作簡便。5）可以根據(jù)客戶需要
3、制備多種標記。1.1.3慢病毒包裝簡要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi干擾載體的構建和質粒純化提取。2）慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉染病毒包裝細胞293T等。3）培養(yǎng)48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。4）病毒的純化和濃縮。5）分裝、-80℃保存。6）滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報告。1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，其復制不依賴于宿主細胞的分裂。有近50個血清型，大多數(shù)Ad載體都是基于血清型2和5，通過轉基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復制能力。這些重組病
4、毒僅在高水平表達E1和E3基因的細胞中復制，因此是一種適用于治療的高效控制系統(tǒng)。1.2.2特點1）幾乎可以感染所有類型的細胞2）可以獲得復制缺陷型(E1和E3缺失)的腺病毒3）病毒滴度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過濃縮后可以達到1012PFU/mL，能有效的進行增殖。4）腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡單.5）感染細胞時，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險，生物安全性高。1.2.3腺病毒包裝簡要流程1）構建表達siRNA/miRNA的腺病毒載體2）采用PacI消化純化的質粒。3）消化好的腺病毒表達載體轉染293A細胞，收獲細胞以制備
5、病毒粗提液。4）將病毒粗提液感染293A細胞以擴增病毒。5）分裝，-80℃保存。1.3、慢病毒和腺病毒的比較慢病毒載體系統(tǒng)和腺病毒載體系統(tǒng)比較病毒表達系統(tǒng)慢病毒表達系統(tǒng)（Lentivirus）腺病毒表達系統(tǒng)（Adenovirus）病毒基因組RNA病毒雙鏈DNA病毒復制自主復制自主復制是否整合病毒基因組整合于宿主基因組，長時間、穩(wěn)定表達外源基因病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時表達外源基因感染細胞類型感染分裂和不分裂細胞，適用于難轉染的原代細胞（如神經(jīng)細胞）及體內(nèi)實驗感染分裂和不分裂細胞表達風度中水平表達高水平表達表達時間慢（1-3天）快（1-2天）滴度
6、滴度最高可達10*8pfU/ml滴度最高可達10*11pfU/ml克隆容量可插入不超過8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入高達8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、構建目的基因到載體2.1構建手段一般是根據(jù)原始質粒信息確定克隆方案，有以下兩種手段。1）如果原始質粒與載體有匹配酶切位點，采用相應的內(nèi)切酶切下相應片段，回收并連接到載體，酶切，并測序鑒定2）如果沒有匹配的酶切位點，則設計帶有特殊接頭的引物進行PCR擴增，得到目的片段，采用相應的內(nèi)切酶切下相應片段，回收并連接到穿梭載體，酶切，并測序鑒定2
7、.2質粒載體2.2.1概念能夠進行自主復制的環(huán)狀DNA雙鏈結構，包括真核生物的細胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細菌細胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子2.2.2特征質粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質粒稱為附加體(episome)，這類質粒能夠整合進真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。質粒在宿主細胞體內(nèi)外都可復制。通過個些特性，人們可以把一些目的DNA片斷構建在質粒中，通過轉化入大腸桿菌中，利用選擇培養(yǎng)基來篩選從而不斷的復制，來得到目的產(chǎn)物。3、質粒DNA在大腸桿菌里
8、轉化連接上目的基因的質粒轉化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴增，然后提取質粒，以下是質粒
