病毒包裝實(shí)驗(yàn)整體流程及原理

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1、病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程及原理目的基因不能直接整合到大多數(shù)真核細(xì)胞，常用的手段是將目的基因包裝成病毒來感染細(xì)胞，從而得到表達(dá)滿足實(shí)驗(yàn)需求。1、病毒的種類病毒有很多種，常見的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。構(gòu)建的siRNA/miRNA慢病毒載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通siRNA載體相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀

2、態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。1.1.2特點(diǎn)1）直接包裝成為假病毒顆粒，對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用，適合RNAi研究和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞)。?2）可以通過簡(jiǎn)單方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株。3）可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。4）無需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡(jiǎn)便。5）可以根據(jù)客戶需要制備多種標(biāo)記。1.1.3慢病毒包裝簡(jiǎn)要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取。2）慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T等。

3、3）培養(yǎng)48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。4）病毒的純化和濃縮。5）分裝、-80℃保存。6）滴度測(cè)定目的基因檢定，并出具檢測(cè)報(bào)告。1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，其復(fù)制不依賴于宿主細(xì)胞的分裂。有近50個(gè)血清型，大多數(shù)Ad載體都是基于血清型2和5，通過轉(zhuǎn)基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復(fù)制能力。這些重組病毒僅在高水平表達(dá)E1和E3基因的細(xì)胞中復(fù)制，因此是一種適用于治療的高效控制系統(tǒng)。1.2.2特點(diǎn)1）幾乎可以感染所有類型的細(xì)胞2）可以獲得復(fù)制缺陷型(E1和E3缺

4、失)的腺病毒3）病毒滴度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過濃縮后可以達(dá)到1012PFU/mL，能有效的進(jìn)行增殖。4）腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡(jiǎn)單.5）感染細(xì)胞時(shí)，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)，生物安全性高。1.2.3腺病毒包裝簡(jiǎn)要流程1）構(gòu)建表達(dá)siRNA/miRNA的腺病毒載體2）采用PacI消化純化的質(zhì)粒。3）消化好的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，收獲細(xì)胞以制備病毒粗提液。4）將病毒粗提液感染293A細(xì)胞以擴(kuò)增病毒。5）分裝，-80℃保存。1.3、慢病毒和腺病毒的比較慢病毒載體系統(tǒng)和腺病毒載體系統(tǒng)比較病毒表達(dá)系統(tǒng)慢病毒

5、表達(dá)系統(tǒng)（Lentivirus）腺病毒表達(dá)系統(tǒng)（Adenovirus）病毒基因組RNA病毒雙鏈DNA病毒復(fù)制自主復(fù)制自主復(fù)制是否整合病毒基因組整合于宿主基因組，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時(shí)表達(dá)外源基因感染細(xì)胞類型感染分裂和不分裂細(xì)胞，適用于難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)感染分裂和不分裂細(xì)胞表達(dá)豐度中水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時(shí)間慢（1-3天）快（1-2天）滴度滴度最高可達(dá)10*8pfU/ml滴度最高可達(dá)10*11pfU/ml克隆容量可插入不超過8kb的外源片段，滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低可插入高達(dá)8kb的外源片段，

6、滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、構(gòu)建目的基因到載體2.1構(gòu)建手段一般是根據(jù)原始質(zhì)粒信息確定克隆方案，有以下兩種手段。1）如果原始質(zhì)粒與載體有匹配酶切位點(diǎn)，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到載體，酶切，并測(cè)序鑒定2）如果沒有匹配的酶切位點(diǎn)，則設(shè)計(jì)帶有特殊接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到穿梭載體，酶切，并測(cè)序鑒定？？？？2.2質(zhì)粒載體2.2.1概念能夠進(jìn)行自主復(fù)制的環(huán)狀DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(D

7、NA)分子2.2.2特征質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。質(zhì)粒在宿主細(xì)胞體內(nèi)外都可復(fù)制。通過這些特性，人們可以把一些目的DNA片斷構(gòu)建在質(zhì)粒中，通過轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，利用選擇培養(yǎng)基來篩選從而不斷的復(fù)制，來得到目的產(chǎn)物。3、質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴(kuò)增，然后提取質(zhì)粒，以下是質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化的三步驟。3.1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的

8、制備1）從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落于3mlLB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。2）取0