病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程及 原理

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1、病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程及原理1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。構(gòu)建的siRNA/miRNA慢病毒載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通siRNA載體相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。1.1.2特點(diǎn)1）直接包裝成為假病毒顆粒，對(duì)分裂和

2、非分裂細(xì)胞均有感染作用，適合RNAi研究和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞)。?2）可以通過簡(jiǎn)單方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株。3）可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。4）無需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡(jiǎn)便。5）可以根據(jù)客戶需要制備多種標(biāo)記。1.1.3慢病毒包裝簡(jiǎn)要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取。2）慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T等。3）培養(yǎng)48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。4）病毒的純化和濃縮。5）分

3、裝、-80℃保存。6）滴度測(cè)定目的基因檢定，并出具檢測(cè)報(bào)告。1.3、慢病毒和腺病毒的比較慢病毒載體系統(tǒng)和腺病毒載體系統(tǒng)比較病毒表達(dá)系統(tǒng)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)（Lentivirus）腺病毒表達(dá)系統(tǒng)（Adenovirus）病毒基因組RNA病毒雙鏈DNA病毒復(fù)制自主復(fù)制自主復(fù)制是否整合病毒基因組整合于宿主基因組，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時(shí)表達(dá)外源基因感染細(xì)胞類型感染分裂和不分裂細(xì)胞，適用于難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)感染分裂和不分裂細(xì)胞表達(dá)風(fēng)度中水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時(shí)間慢（1-3天）快（

4、1-2天）滴度滴度最高可達(dá)10*8pfU/ml滴度最高可達(dá)10*11pfU/ml克隆容量可插入不超過8kb的外源片段，滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低可插入高達(dá)8kb的外源片段，滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、構(gòu)建目的基因到載體2.1構(gòu)建手段一般是根據(jù)原始質(zhì)粒信息確定克隆方案，有以下兩種手段。1）如果原始質(zhì)粒載體有匹配酶切位點(diǎn)，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到載體，酶切，并測(cè)序鑒定2）如果沒有匹配的酶切位點(diǎn)，則設(shè)計(jì)帶有特殊接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)

5、片段，回收并連接到穿梭載體，酶切，并測(cè)序鑒定2.2質(zhì)粒載體2.2.1概念能夠進(jìn)行自主復(fù)制的環(huán)狀DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子2.2.2特征質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。質(zhì)粒在宿主細(xì)胞體內(nèi)外都可復(fù)制。通過個(gè)些特性，人們可以把一些目的DNA片斷構(gòu)建在質(zhì)粒中，通過轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中

6、，利用選擇培養(yǎng)基來篩選從而不斷的復(fù)制，來得到目的產(chǎn)物。(為了擴(kuò)增DNA)3、質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴(kuò)增，然后提取質(zhì)粒，以下是質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化的三步驟。(為什么不進(jìn)行PCR，因?yàn)椴荒茏觥?3.1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1）從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落于3mlLB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。2）取0.4ml菌液轉(zhuǎn)接到40mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2~3h3）菌液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，冰上放置10min4）4℃離心10min（40

7、00r/min）5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡6）用冰浴的0.1mol/L氯化鈣10ml懸浮細(xì)胞沉淀，立即冰浴30min7）4℃離心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化鈣2ml懸浮細(xì)胞（冰上放置）9）分裝細(xì)胞，200ul一份，4℃保存3.2質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化1）取200ul新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)粒DNA2ul混勻，冰浴30min2）離心管放到42℃保溫90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1h（150r/min）5）取適當(dāng)體積（100u

8、l）的復(fù)蘇細(xì)胞，涂布在選擇性培養(yǎng)基上，正置30min6）倒置平皿37℃，12~16h，出現(xiàn)菌落3.3質(zhì)粒提取步驟1）取1~4ml在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液，12000轉(zhuǎn)離心1min，棄上清2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ為細(xì)胞懸浮液）混合液，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮，室溫靜置1-2min。3）加入250ul溶