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1、__________________________________________________慢病毒包裝系統(tǒng)簡介及應用一、慢病毒包裝簡介及其用途慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮
2、細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景。目前慢病毒也被廣泛地應用于表達RNAi的研究中。由于有些類型細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達siRNA的載體，然后轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定
3、表達載體的細胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達載體中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導RNA合成的，這是因為RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶polyA尾。當RNA聚合酶Ⅲ遇到連續(xù)4個或5個T時，它指導的轉(zhuǎn)錄就會停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3'端形成1~4個U。U6和H1RNA啟動子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達～21ntRNA和～50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stemloop）。在siRNA表達載體中
4、，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄，然后兩條鏈互補結(jié)合形成siRNA；也可由載體直接表達小發(fā)卡狀RNA(smallhairpinRNA,shRNA)，載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動子和4～5T轉(zhuǎn)錄終止位點之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有1~4個U3'突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細胞內(nèi)進一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達載體。慢病毒載體（Lentiviralvector）
5、較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達shRNA，實現(xiàn)在多種類型的細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達降低的動物提供了可能性。慢病毒表達載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有
6、輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時共轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。收集于網(wǎng)絡，如有侵權請聯(lián)系管理員刪除__________________________________________________二、這一系統(tǒng)的目的，主要是為了解決以下問題：1.對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分
7、化的細胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi，cDNA克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。2.進行穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選；3.為活體動物模型實驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液；在細胞相關的實驗操作中，對于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細胞，通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉(zhuǎn)導效率，以達到目的基因的高效瞬時表達。三、慢病毒載體介紹慢病毒載體（Lentiviralvector,LVs）是在HIV-1病毒基礎上改造而成的病毒載體系
8、統(tǒng)，它能高效的將目的基因（或RNAi）導入動物和人的原代細胞或細胞系。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，其基因組進入細胞后，在細胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為DNA，形成DNA整合前復合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產(chǎn)生RNAi干擾。慢病毒載體介導的基因表達或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細胞基因組中，并隨細胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細胞中。以上特性使慢病毒載體與其它
